动物细胞核制备试剂盒（密度梯度法）

动物细胞核制备试剂盒（密度梯度法）

原理及特点 用高密度介质来分离动物软体组织（如肝脏、脾脏等）细胞核是目前主流的方法，它是由 Chauveau 于 1956 年发明，其原理是细胞核的密度较大，在高速离心条件下（40 000g 1 小时）可在高密度介质（2.2mol/l 蔗糖溶液）中沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开的目的。该方法能通过一步离心得到较高纯度的细胞核，得到广泛应用。本产品就是在 Chauveau 方法的基础上优化改进而来，它具有下列特点：
1. 基于密度梯度分离，可有效去除细胞质及其他细胞器，得到的细胞核纯净，
2. 加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质渗透压的物质，减少了细胞核的脆性，增加了细胞核的完整性。
3. 精心调节了介质的 pH，防止细胞核在分离过程中的聚集，还能保持细胞核的精细结构
4. 快速，整个操作过程仅需 1 小时即可完成（对一个样品而言）。
5. 提供染色试剂，可以在普通光学显微镜下检测纯化的细胞核的纯度。
6. 处理温和，得到的细胞核中的大部分蛋白质都具有活性，可以用于胶迟阻实验、酶活性分析细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究；也可用于超大片段 DNA 的纯化。
7. 不但适用于动物和植物培养细胞，还能用于实体组织（能用 Dounce 或Potter 匀浆器匀浆的组织均可）。
8. 一次微量提取足够处理 0.1 克组织或 10E7 个培养细胞，本产品足够 50次微量提取。
运输及保存 常温运输和保存，有效期一年
自备试剂 手动或电动 Dounce 或 Potter 组织匀浆器（研磨杵和套管的空隙好为 0.1mm，如果小于细胞核的直径，则会使细胞核破裂）、水平式低温高速离心机、光学显微镜。
使用方法 一、准备工作：先将溶液 A 的成分二（干粉）全部加入到溶液 A 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到 100mL 溶液 A。将溶液 B 的成分二（干粉）全部加入到溶液 B 成分一（溶液）中，摇晃溶解后得到 50mL 溶液 B。4℃放置不能超过 2 天，长期放置需要放-20℃。

二、微量细胞核分离（放量提取各试剂的用量可以按比例放大）：
1. 对组织细胞：称取 100~200 mg 新鲜组织（如动物肝脏、脑、心肌和植物叶片等），用自备的 PBS 或生理盐水洗净血水，滤纸吸干，用剪刀或刀片将其剪为碎块（好大小为 1cm3，过小反而不利于匀浆）放入小容量Dounce 或 Potter 玻璃匀浆器内。
2. 对培养细胞：用自备胰酶按标准方法消化培养细胞，PBS 洗涤，800×g5~10 分钟离心收集细胞，计数。每次微量提取需要 5 × 10E7 个细胞，加入 1.0 mL 预冷的溶液 A 重悬细胞，然后转移到小容量 Dounce 或Potter 玻璃匀浆器内，
3. 用 Dounce 或 Potter 组织匀浆器在冰上破碎组织或细胞。如果用手动匀浆器，一般需要 20~30 次。如果用电动匀浆器，一般需要处理 3-5 次，每次 5～10 秒钟（转速为 500r/min）。推荐使用的两种匀浆器，空隙为 0.1 mm
4. 将匀浆液转移到离心管中。如果匀浆液有可见的结缔组织和未破碎的组织块，可以用三层自备的纱布放在 1.5 mL 离心管管口，将匀浆液过滤进入离心管。可取少量滤液涂在载玻片上制得涂片 A，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
5. 4℃，700-800×g 水平离心 5-10 分钟。细胞核沉淀在收集管底部，弃上清。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片 B，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
6. 加入 0.5 mL 预冷溶液 A 重悬沉淀。用预冷的匀浆器（用前需要将表面的组织洗去）重悬沉淀。可取少量上清液涂在载玻片上制得涂片 C，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
7. 在水平型离心管中加入 0.5mL 预冷的溶液 B，然后靠管壁慢慢加入上步得到的重悬液。
8. 在 4℃ 23000g 离心 30 分钟，管底的沉淀即为细胞核。
9. 小心吸弃上清液。注意：上清一般比较粘稠，好倒立一段时间。
10.用 0.5 mL 溶液 A 重悬沉淀。
11.在 4℃ 1500g 离心 5 分钟，吸弃上清，沉淀即为纯净的细胞核。可以直接使用，也可以加等体积的自备甘油，混匀后放液氮或-70℃保存。可取少量上悬浮液涂在载玻片上制得涂片 D，自然干燥涂片以便染色做显微镜观察。
12.用本方法一般可以从 0.1g 肝脏组织中纯化到 1-2×107 个细胞核。如果后续试验是 Western Blot 和 2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解细胞核后上样。
三、显微镜检测涂片，计算效率
1. 将干燥后的 A-D 四张涂片加入固定液固定 15 分钟，晾干。
2. Giemsa 染液染 10 分钟。
3. 自备蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水。
4. 用显微镜（40×）检查涂片，细胞核将呈紫红色，混杂的细胞质为浅蓝色碎片。根据每步细胞核的数量可以粗略估计回收效率。