改良Lowry法蛋白定量试剂盒
产品及特点Folin 酚试剂(磷钼酸和磷钨酸混合物)跟蛋白质中含酚氨基酸(色氨酸和酪氨酸)发生颜色反应,可用于测定蛋白质浓度,但灵敏度较低。Lowry在此基础上加入 Biuret(双缩脲)反应步骤,即先在碱性条件下使蛋白质和Cu+形成复合物,再使其与 Folin 酚试剂发生显色反应,产物在 750nm 检测。Lowry 法使不含酚的蛋白质也能被检测出来,灵敏度是单独使用 Folin 酚的10 倍左右,是双缩脲反应的 200 倍,因此成为早期检测蛋白浓度的主要方法。Lowry 检测原理图如下:传统 Lowry 法受到很多常用的试剂(如 DTT、糖、甘油、Triton 等)干扰,步骤繁琐。本公司对 Lowry 法进行改良,具有下列特点:
1. 即开即用,不需要单独购买每个成分再配制。
2. 能抵抗部分干扰物(如一定浓度 SDS 或其他去污剂)的干扰。
3. 检测线性范围广,在 2-100 μg,检测上限比经典 Lowry 法高 30%-40%。
规格及成分 成份 编号 1000 次包装
溶液 A 成分一 LM101102A1 208 mL
溶液 A 成分二 LM101102A2 16 mL
溶液 A 成分三 LM101102A3 16 mL
溶液 B LM101102B 80 mL
溶液 C LM101102C 80 mL
福林酚 LM100939 10 mL(用 100 mL 棕色瓶)
BSA 标准品
(2 mg/mL in 水) 101102D 1 mL
使用手册 1 份
运输及保存 常温运输和保存(但 BSA 标准品需要-20℃保存),有效期一年。
自备试剂 去离子水、蛋白样品、样品缓冲液
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法 一:准备工作
1、 制备溶液 A:将 16 mL 溶液 A 成分二和 16 mL 溶液 A 成分三加入到装液 A 成分一的塑料瓶中,混合均匀得到 240 mL 溶液 A。注意:溶液 A各成分分开提供更加稳定。
2、 制备 Lowry 工作液:将溶液 A、溶液 B 和溶液 C 按 3:1:1 的体积比混合得到 Lowry 工作液。此工作液可以室温放置 2-3 周,所以最好用多少配多少。如果发现溶液 B 或溶液 C 有沉淀,需 37℃溶解并摇匀后再使用。
3、 制备福林酚工作液:在装有 10 mL 福林酚的棕色塑料瓶中加入 90 mL 去离子水,摇晃混匀待用。此工作液在避光条件下可以放置 6 个月。
二:试管法
4、 先用去离子水将 BSA 标准(2 mg/mL)稀释到 50 ug/mL,然后在标记的试管中加入下列成分(单位:uL)。注意:每个样品最好做三个稀释度,每个稀释度最好设置三次重复,阴性对照和标准品也最好做三次重复。
标准品(每个做三次重复,此处只列出一个)
编号 BSA 标准
(50 ug/mL) 水 总体积
阴性对照 0 0 200
1 0 200 200
2 25 175 200
3 50 150 200
4 100 100 200
5 150 50 200
6 200 0 200
样品(以 1 个样品、3 个稀释度为例,每个稀释度三个重复,
此处只列出一个)
编号 样品 总体积
1 200 (稀释度 1) 200
阴性对照 1
200(用稀释度 1 稀释的溶解蛋
白样品的缓冲液) 200
2 200 (稀释度 2) 200
阴性对照 2
200(用稀释度 2 稀释的溶解蛋
白样品的缓冲液) 200
3 200 (稀释度 3) 200
阴性对照 3 200(用稀释度 3 稀释的溶解蛋
白样品的缓冲液) 200
5、 每管中加入 200 uL Lowry 工作液,振荡混匀后室温反应 10 分钟。
6、 每管中加入 100 uL 福林酚工作液,振荡混匀后室温反应 30 分钟。
7、 用容量为 0.5 mL、光径为 1 cm 的玻璃比色杯或聚苯乙烯比色杯测定 750nm 的光吸收。测定时,先空白(即阴性对照)后样品,测定样品和 BSA标准品时,先低浓度后高浓度。测定未知样品前需要将杯子清洗干净,必要时可以用甲醇清洗吸附到比色杯壁上的染料。
8、 根据标准品三个重复的平均值绘制标准曲线,然后根据未知样品的光吸收从标准曲线中查得其对应的浓度。
三:96 微孔板法
9、 同上,只是反应用 96 微孔板设置,用酶标测试仪 750 nm 测定光吸收。
四、样品中干扰物质的去除(本产品不含相关产品,如果样品中有干扰 Lowry 法蛋白定量的物质(见附表),可另购本公司的微量蛋白质沉淀试剂盒(CAT#:81217-50)去除,也可以用自备试剂按下法去除:用水将样品调到体积为 200 uL, 加入 20 uL 0.15%去氧胆酸钠,混匀,室温放置 10 分钟。加入 20 uL 72%的 TCA,室温放置 5 分钟。3000 g 离心
15 分钟,小心去除上清。用 200 ul 水溶解蛋白沉淀后以用于 Lowry 法测定。附:常见 Lowry 法蛋白定量干扰物(低于所列浓度不干扰,高于所列浓度则会干扰,需要按上法去除。不能含任何浓度的 DTE,DTT 和硫酸胺)。干扰物 浓度 干扰物 浓度
Acetone 10% 2-Mercaptoethanol 1 mM
Aprotinin 10 mg/mL NaCl 1 M
CHAPS 0.05% NaOH 100 mM
DMF 10% NaPi 100 mM
DMSO 10% NP40 0.02%
EDTA 1 mM PMSF 1 mM
EGTA 1 mM SDS 1%
Ethanol 10% Sodium Citrate 100 mM
Glucose 100 mM Sucrose 7%
Glycin 100 mM Tris 10 mM
HEPES 1 mM Trition X-100 0.03%
Imidazole 25 mM Tween 20 0.05%
Methanol 10% Urea 3M