超敏型BCA法蛋白定量试剂盒
产品及特点
本产品是在 BCA 法蛋白定量试剂盒(CAT#:80815-500)基础上改进的超敏蛋白定量试剂盒,尤其适合对低浓度的蛋白质溶液进行定量分析。它具有下列特点。
1. 超敏感,最低检测浓度为 0.5μg/mL。
2. 线性范围在 0.5~20μg/mL,尤其适用于低浓度的样品。
3. 对大多数离子型和非离子型去污剂不敏感,但对 Cu 的还原剂和螯合剂敏感。
4. 比 Lowry 法更加简单快捷,45 分钟内完成测定。
5. 试剂稳定,但工作液 1 天内有效。
6. 终产物稳定,检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。
7. 最短可以检测双肽,所以适合于分子量较小的蛋白质,而 Bradford 法需要一定大小的蛋白质。
运输及保存 常温运输和保存,但 BSA 标准品需要低温运输,-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 样品缓冲液
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法
1. 用合适的方法制备待测蛋白样品,并把蛋白质溶解在合适的样品缓冲液中。
本检测方法受待测样品中螯合剂和还原剂的影响,所以需确保蛋白溶液中,
EDTA 的终浓度不高于 10mM、二硫苏糖醇不高于 1mM、β-巯基乙醇不高
于 1mM,没有任何 EGTA。如果达不达上述要求,则需要稀释样品,使其
浓度降低到上述浓度之下。
2. 将本试剂盒提供的 BSA 标准品(2 mg/
溶液 C 混合即可,所得溶液即超敏 BCA 工作液。
4. 取一块 96 孔板,按下表加入上步新鲜制备的 BSA 工作液、待测蛋白样品和
自备样品缓冲液:
编号 BSA 工作液
(μL)
待测样品
(μL)
样品缓冲液
(μL)
总体积
(μL)
蛋白含量
(μg)
0 0 0 150 150 0
1 5 0 145 150 0.2
2 10 0 140 150 0.4
3 20 0 130 150 0.8
4 40 0 110 150 1.6
5 60 0 90 150 2.4
6 80 0 70 150 3.2
7 100 0 50 150 4.0
N 个待测样品 0 μL 补到 150 150 待测
5. 在每个孔中加入 1 倍体积(即 150 μL)的超敏 BCA 工作液并混匀。如果用
排枪加入并混匀则更好。也可把 96 孔板放在振荡器上振荡 30 秒混匀。
6. 60℃放置 1 小时。
7. 冷至室温,迅速在 562 nm 下比色测定其余样品的光吸收。如酶标仪没有
562 nm 的设定,可用接近的波长检测,如 570nm。测定操作最好在 10 分
钟内完成,否则化学反应还在继续进行,光吸收值每 10 分钟会升高 2.5%左
右。
8. 处理数据:将编号为 0 号的样品(对照)的读数从其余所有样品(包括 0 号
样品,其读数变成零)中扣除。
9. 制作标准曲线:以 0-7 号样品的 BSA 含量(单位 μg,见上表最右行)为横
坐标,以上一步得到的样品吸光值(扣除背景读数的)为纵坐标,绘出 BSA
的标准曲线。
10. 再将 N 个待测样品的吸光值(减去 0 号样品的读数后)标在标准曲线上,其
在横坐标上对应的蛋白含量(μg)就是待测样品中的蛋白质含量,除以样品
稀释液总体积(20μL),乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位:
μg/μL)。
二:注意事项
11. 加工作液后也可以在室温放置 2 小时,或 60℃放置 30 分钟。超敏 BCA 法
测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温
度升高而加快。所以,如果蛋白质浓度较低,可以改在 60℃孵育 60 分钟。
12. 待测样品浓度在 20~2000 μg/mL 范围时有较好的线性关系。
13. 超敏 BCA 法测定蛋白浓度时,不受下列化学物质的影响:
名称 浓度小于下面数值时不受影响
Ammonium S μLfate 1.5 M
Brij-35 5.0%
CHAPS 5.0%
EDTA 10 mM
Hepes 100 mM
Glycine, pH 2.8 100 mM
Guanidine HCl 4.0 M
Tween 20、60、80 5.0%
SDS 5.0%
Sodium Acetate pH 5.5 200 mM
Sodium Chloride (NaCl) 1.0 M
Sucrose 40%
Sodium Hydroxide (NaOH) 0.1 M
NP-40 5.0%
Triton X-100 5.0%
Urea 3.0 M
本试剂受温度和时间影响较大,故需要准确定时和定温,以保证精确定量。