农杆菌EHA101感受态细胞

农杆菌EHA101感受态细胞

产品及特点EHA101 菌株为 C58 型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因 rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型 Ti 质粒 pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有 vir 基因，vir 基因是 T-DNA 插 入植物基因组必需的元件。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型 Ti 质粒含有筛选标签：kan，赋予 EHA101 菌株卡那 霉素抗性，适用于玉米、水稻、烟草等植物的转基因操作。本公司生产的 EHA101 化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pK7WGF2 质粒（壮观霉素抗性）检测 转化效率>104cfu/μg DNA。EHA101 农杆菌的基因型是：C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA)(kanR) Nopaline 
规格及成分 成分 编号 10 支包装
EHA101 农杆菌感受态细胞 161205A 10×100 μL
pKWGF2（10ng/uL） LM161205B 10 μL
使用手册 1 份

运输及保存 干冰运输，-80℃保存，有效期一年。

自备试剂 质粒 DNA、液氮等

使用方法 转化前准备

1. 冰水浴和 37℃水浴。

2. 液氮或干冰/乙醇混合物。

3. 将抗性平板在 28℃培养箱中平衡至少 15 分钟。

转化方法

1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2. 每 100μL 感受态加 1μg（体积不大于 10 μL）质粒 DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置 5 分钟、液氮 5 分钟、37℃水浴 5 分钟、冰浴 5 分钟。

3. 加入 700μL 无抗生素的 LB 或 YEB 液体培养基，于 28℃振荡培养 2~3 小时。

4. 6000rpm 离心一分钟收菌，留取 100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒置放于 28℃培养箱培养 2-3 天（当平板只含有转化所用双元载体抗生素时，28℃培养 48 小时即可；平板中同时加入双元载体抗生素，20 μg/ml rif 时，需 28℃培养 60 小时；如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 则需要 28℃培养 72-90 小时）。

注意事项

4. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

5. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

6. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

7. 利福平浓度不应高于 25 μg/mL，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司 EHA101 感受态计算转化效率时所用平板只含有 50 μg/mL kan，若所用平板含有 20 μg/mL rif 则转化效率降低到 1/2。

8. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质粒丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti 质粒丢失的概率极低(可以忽略)。