DNA去磷酸化试剂盒

DNA去磷酸化试剂盒

产品及特点 分子克隆时，载体的自连极大降低了连接效率，如果对载体 DNA 两个 5′端的-PO4 基团进行去磷酸化处理，则可以抑制自连反应。此外在进行 DNA 5′端标记前，也需要将其本来的-PO4 基团去除以便加上标记基团。本公司开发的 DNA 去磷酸化产品就是针对这一目的而开发。它具有下列特点：

1. 把 DNA 5′端的-PO4 基团变成-OH 基团，使其丧失连接能力。

2. 模板可以是单链 DNA，也可以是双链 DNA，既可以是平末端，也可以是 5′端突出或 3′端突出的粘性末端。

3. 处理后的核酸纯化后可以直接用于连接反应和标记反应。

4. 本产品足够 20 次 20μL 体系的去磷酸化实验

5. 本产品仅供科研使用。
规格及成分成 份 编 号 塑料袋包装
10×去磷酸缓冲液 130828a 50 μL（紫盖）
碱性磷酸酶 130828b 10 μL（红盖）
超纯水 100935 1 mL（蓝盖）
使用手册 130828sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期为 12 个月。

自备试剂 DNA 片段

使用方法 注意：dNTP 和 ATP 也是碱性磷酸酶的底物，所以如果 DNA 溶液中有 dNTP（比如 PCR 产物中）和 ATP，一定要先将其去除，否则它们会耗掉大量的碱性磷酸酶活性，降低 DNA 去磷酸化效率。

一、纯化 DNA 片段的去磷酸化 

1、在微量离心管中配制下列反应液（20μL）：

成 分 用 量

胶回收的 DNA 片段 1 pmol（相当于 1ug 3Kb 的线状质粒）

10×去磷酸缓冲液 2 μL

碱性磷酸酶 0.5 μL

超纯水到 20 μL

2、建议在 37℃反应 30 分钟（对平末端、5′端突出或 3′端突出的 DNA 片段均采用此保温条件）。

3、65℃反应 5 分钟变性碱性磷酸酶。

4、DNA 片段可以直接用于连接。

二、限制性酶切反应的同步去磷酸化

5、本碱性磷酸酶在几乎所有限制性内切酶的缓冲液中都有活性，所以可以按 1ug3Kb DNA 加 1μL 碱性磷酸酶的比例直接加到限制内切酶的反应液中（反应液中不能含 dNTP 和 ATP）。

6、加热灭活限制性内切酶和碱性磷酸酶（灭活条件根据限制性内切酶不同而不同，但不能低于 65℃，时间不能短于 5 分钟，否则不能灭活碱性磷酸酶）。灭活后的样品可以直接用于后续实验。

7、如果不能采取加热灭活限制性内切酶和碱性磷酸酶，则需酚/氯仿抽提去除酶。具体操作如下(本试剂盒不提供相关试剂，需要从本公司另购相关试剂，下列操作仅供参考)：

附：酚/氯仿抽提去除酶步骤：

1、在反应液中加入超纯水使体积变成 100μL，以免纯化过程中 DNA 丢失。如果有必须，可以加入和 4μL 核酸助沉剂提高回收效率。

2、加入 100μL 酚/氯仿/异戊醇 25：24：1 混合液震荡半分钟混匀，室温 12000g离心 3 分钟，转移上清到新离心管中。

3、加 0.1 倍体积（即 10μL）的 3 M 乙酸钠溶液（pH 5.2）。

4、再加入 2.5 倍体积（即 250μL）的无水乙醇。

5、混匀后 12000g 4℃离心 10 分钟，小心弃上清。

6、加入 1mL 70%乙醇，短暂离心 3 分钟后小心弃上清。

7、短暂离心 5 秒，吸弃残留液体（约 30-50μL）。

8、室温放置 2 分钟干燥后加入适量的超纯水溶解 DNA，立即使用或放-20℃长期保存。