T3体外转录试剂盒
产品及特点 本试剂盒是基于沙门氏噬菌体 T3 RNA 聚合酶的 RNA 体外转录试剂盒,它利用含有 T3 启动子的模版 DNA,以 NTP 为底物,从 T3 启动子下游开始合成与模板 DNA 中一条链互补的 RNA,简单快速获得大量的 RNA 分子。本产品具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需提供含 T3 启动子的 DNA 模板即可以进行体外转录实
验,不需单独准备每一个成份。
2. 单溶液预配液,减少加样次数,避免了操作误差,增加了可重复性。
3. 模板 DNA 可以是线性化的质粒 DNA,也可以是 PCR 扩增产物。
4. 可以合成的 RNA 的佳长度在 20 nt 到 5000 nt 之问。
5. 产品配方经过精心优化,每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。
6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 结构研究、核解生物化学、体外翻译、RNA蛋白质相互作用、反义技术、SELEX技术和 RNA 干扰(RNAi)等实验。
规格及成分 成份 编号 十孔盒包装
2×T3 转录预配液 LM91108a 0.5 mL(本色盖)
T3 RNA 聚合酶混合液 LM120309 50 μL(红色盖)
RNase-free 水 LM80403 1 mL(亮黄盖)
使用手册 LM91108sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 如果需要去除转录产物中的 DNA 模板,则需要 RNase-free DNase 、Tris 饱和酚、氯仿、微量核酸沉淀剂、RNase-free 75%乙醇(均可从本公司另购)
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法 一、制备 DNA 模板
PCR 片段和质粒 DNA 都可以用作体外转录的模板,但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的 DNA。如果是质粒 DNA,则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的 DNA 序列的上游必须有 T3 启动子。如果模板是 PCR 产物,则可以在设计引物时将 T3 启动子序列(5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’)加上。如果是将 DNA 片段克隆到载体上,则需要选择有 T3 启动子的载体,并且克隆位点必须位于 T3 启动子下游。三是需要转录的 DNA 序列的下游端好不要是 3’突出。如果是 3’突出(如选择了 Pst I 来线性化质粒),则好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必须保证 DNA一般要使用大量的 RNase A,因此质粒 DNA 一般都有严重的 RNase A 污染,所以在用作模板前,好采取胶回收得方法回收质粒 DNA。并且加入少量总 RNA 一起保温,然后电泳检测 RNA 是否被降解,以此判断纯化的DNA 模板是否有残留 RNase A。
二、体外转录反应
1. 如果有 N 个样品,强烈建议做一个阴性对照,故共设置 N+1 个反应,这样一起并排电泳时容易判断哪个条带是模板 DNA,哪个条带是扩增得到的RNA。在 N+1 个 RNase-free 的塑料离心管中,在室温下(不是在 4℃下)
按次序加入下列成分:
成分 N 个样品管 阴性对照
DNA 模板 各 50 ng(PCR 片段模板)
或各 1μg(质粒模板)
50 ng(PCR 片段)
1μg(质粒 DNA)
2×T3 转录预配液 10 μL 10 μL
T3 RNA 聚合酶混合液 1 μL 不加
RNase-free 水 补水到 20μL 补水到 20μL
注:此为 20μL 反应体系的用量,对其他体积的反应体系,各成分的用量可以按比例增减。如果需要标记 RNA 探针,则需要另购 NTP 与 2×T3 转录预配液分开提供的试剂盒。如果需要得到加帽 RNA,则需要加入自备的加帽修饰核苷酸(NEB 提供各种加帽修饰核苷酸)。
2. 37℃保温 1-2 小时。注意:延长保温时间并不能提高产量。
3. 70℃加热 10 分钟灭活 T3 RNA 聚合酶。
4. 取 1-3μL 电泳检测转录效果。比阴性对照多出的条带就是扩增得到的 RNA(由于检测时的电泳不需要碱变性胶,并且合成的 RNA 长度不一定均匀,即使长度均匀,但由于自生形成发夹结构,因此不一定呈现清晰的电泳条带。但由于 RNA 是单链,分子量比同样长度的 DNA 小一倍,因此转录得到的 RNA 一般比其模板电泳速度更快。
5. 定量,可以用自备的单链 RNA 定量试剂盒检测浓度,也可以肉眼比较电泳胶上 RNA 和 DNA 的强度。由于 RNA 是单链,跟核酸染料结合力低,因此同等亮度的 RNA 条带,其 RNA 分子数一般比 DNA 的分子数多一倍。使用本试剂盒时 1μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA。
6. 得到的 RNA 可以放-80℃保存(溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP)。
注:若需进一步去除 T3 转录反应体系中的 DNA 模板,可参考下列操作步骤,但所用试剂需另行购买,本试剂盒不提供。
1. 在体外转录结束后,在反应体系中加入 3-5 U 自备的 RNase-free DNase。
2. 37℃保温 15-30 分钟。
3. 补水到 100 μL,
4. 用自备的等体积(100 μL)的Tris饱和酚-氯仿抽提一次去除残留的DNase和 RNA 聚合酶。
5. 在上清中加 200 μL 自备的微量核酸沉淀剂(CAT#50903;用前需要摇晃混匀),振荡后 15000 rpm 离心 3-5 分钟,弃上清。
6. 加入 1 mL 75%乙醇,震荡 10 秒后 15000 rpm 离心 3-5 分钟,弃上清。
7. 短暂离心数秒,用枪头吸弃上清。
8. 晾干半分钟,所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free水中后立即使用或放-80℃长期保存。