两管式RT-PCR试剂盒(AMV-Taq)
产品及特点本产品使用重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, AMV RT),从总 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成一链 cDNA 的试剂盒, 含有 cDNA 一链合成所需的所有试剂。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的 活性,能够作用于 GC 含量高,二级结构复杂的 RNA。合成的一链 cDNA 可广泛应用于 第二链合成、杂交、PCR 扩增、Real-time PCR 反应等。
1. 即开即用,足够 50 次 RT 反应(20μL 体系)和 600 次 PCR 反应(30μL 体系)。
2. cDNA 一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物,适合 各种情况。
3. 两管式操作,RT 和 PCR 在不同试管中进行,便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。
4. 全长的一链 cDNA 产量高,最长可合成 8 kb 的 cDNA。
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
AMV 逆转录酶 (含 RI) 130921a 50 μL
AMV RT Buffer(含 dNTP) 130921b 300 μL
Oligo (dT)18引物(0.5 μg/μL) 100814 50 μL
随机引物(0.5 μg/μL) 100409 50 μL
PCR MagicMix 3.0,含染料 90805 9 mL
RNase-free 水 80403 5 mL
使用手册 130921sc 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。
自备试剂 样品 RNA、模板专一正向和反向引物。
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法 一、样品 RNA 的制备(本试剂盒不提供相关试剂)
1. 可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA,也可以选用其他供应商的产品,但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。
二:RT(逆转录)反应合成 cDNA
2. 按下表配制 RT 反应体系(20 μL 体系):
RNA 模板
总 RNA < 5 μg
或 poly(A) mRNA
或随机引物(0.5 μg/μL) 1 μL
或自备模板专一反向引物(20 pmol/μL) 1-2 μL
RNase-free 水 补水到 13 μL
注意:RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度(成反比)。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物,但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA(只占 5%左右),则可优先选用 OligodT 引物,这样就可以排除非 mRNA 的干扰。
3. 轻轻混匀后离心 3-5 sec,反应混合物在 65℃温浴 5 min 后冰浴 30 sec,离心 3-5 sec。
将试管冰浴,再加入如下组分:
AMV RT Buffer(含 dNTP) 6 μL
AMV 逆转录酶(含 RI) 1 μL
轻轻混匀后离心 3-5 sec。
在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应:
cDNA 合成 42℃ 30-60 min;
终止反应 85℃ 5 min(酶失活),处理后,置于冰上放置。
注意:若使用 Oligo dT 引物或序列特异性引物,进行 42℃,30-60 min 反应; 若
使用随机引物,应先进行 25℃,10min 反应,然后进行 42℃,30-60 min 反应。
三、PCR(30 μL 体系)
4. 在 PCR 管中加入下列成分:
成分 加入量
PCR MagicMix 3.0,含染料 15 μL
cDNA 样品(上步的 RT 反应液) 1-5 μL
模板专一性正向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL
模板专一性反向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL
补水到 30 μL
注意:cDNA 也可以稀释后作 PCR 模板。是否稀释或稀释倍数取决于靶基因的丰度。
5. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定,下面的只做参考):
过程 温度 时间
预变性 94℃ 5 min
PCR 反应
(35 个循环)
94℃ 1 min
55℃ 1 min
20191012ww
72℃ 2 min
后延伸 72℃ 10 min
四、电泳检测
取 5-10μL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳,跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注:本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料,可以直接上样,不需要额外再加电泳上样液。