2X染料法荧光定量PCR Mix
产品及特点本产品是基于荧光染料检测的即用型 PCR 试剂盒,可以对靶片段进行实时定量 PCR分析(quantitative PCR、qPCR)。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2及新型荧光染料 DNAgreen 等所有实时定量 PCR 所需要的成分,用户只需加入模板和引物即可进行实时定量 PCR 反应和 HRM 分析,具有广泛的用途。
1. 方便,用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量 PCR 实验和 HRM(HighResolution DNA Melt Curve Analysis)分析。而基于 SYBR Green I 和 LC Green染料的 qPCR mix 则不能同时用于上述两种实验。
2. 使用第三代饱和型荧光染料,信号强,不会抑制 PCR 反应。
3. 快捷,即用型的预配液使加样操作步骤大大简化,避免了交叉污染,降低实验误差。
4. 各成分的浓度和比例都经过精心优化,反应的灵敏度高,特异性强。能检测到浓度为50 拷贝/mL 的靶分子。
规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装 塑料袋包装
2×SYBR qPCR MagicMix 90408 1 mL(棕色盖) 1 mL×6
使用手册 90408sc 1 份 1 份
运输及保存 低温运输,-20℃保存, 保存期限为 6 个月。
自备试剂 DNA 模板、引物、超纯水。
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法
1. 以 20 uL 的 qPCR 反应体系为例:在一干净的 PCR 管中,加入下列成分:反应体系成分 20 uL 体系 终浓度
2×SYBR qPCR MagicMix 10 uL 1×自备引物一 a x uL 0.1-0.5 uM自备引物二 a x uL 0.1-0.5 uM自备模板 a x uL自备 ROXb 2 uL (可以不加)补超纯水到 20 uL放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。
注意:
a) 通常引物浓度以 0.2 μM 可得到较好结果,可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考;通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定佳的模板使用量。
b) ROX 校正染料:如果使用 ABI 公司的 7500,7700 和 7900 三种型号的荧光PCR 仪器,则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900,ROX的佳浓度为1×(即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX)。对ABI 7500,ROX 的佳浓度为 0.05-0.1×(每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX;也可将 10×ROX 稀释到 1×,然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX)。ROX会在溶解曲线中产生噪音,因此,如果出现了杂峰,将软件中“Passive Reference
Dye”中的“ROX”选项取消打勾,然后重新分析数据。对 于 iCycler IQ, MJ Opticon ,MJ Chromo4 ,MX3000, MX4000,RotorGene3000,RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光 PCR仪器,ROX 不是必须的,但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。
2. 循环步骤:根据扩增子的性质和仪器性能,从以下三个过程中任选一个进行扩增。
A:两步快速循环法:适用于引物 Tm 值设计为 60℃的反应循环步骤 温度 时间 循环数酶活化 95℃ 10 min 1
变性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
1 min
35-40
注意:本产品所采用的热启动酶须在预变性 95℃、10 min 条件下实现酶的活化。退火温度请以 60-64℃作为设定范围的参考,发生非特异性反应时,可提高退火温度。
B:三步快速循环法:适用于延伸步骤温度高于退火步骤的 PCR(长引物 PCR)
循环步骤 温度 时间 循环数
酶活化 95℃ 10 min 1
变性
退火
延伸
95℃
56-64℃d
72℃e
10 s*
30 s
32 s
35-40
注意:
a) 退火温度:建议采用两步法 PCR,退火温度 60℃进行反应。若提高反应特异性,可提高退火温度,以 60-64℃作为设定范围的参考。若因使用 Tm 值较低的引物等原 因,得不到良好的实验结果时,可尝试进行三步法 PCR 扩增,三步法的退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度:延伸温度设为 72℃通常可以提高扩增效率。但是,对于 AT 含量大于 70%的扩增子来说,延伸温度设为 60℃为宜。
C:通用循环法:这种循环方法适用于几乎所有的荧光 PCR 仪,也适用于用快速循环法不能扩增的模版。
循环步骤 温度 时间 循环数
酶活化 95℃ 10 min 1变性
退火&延伸
95℃
60℃
15 s
60 s
35-40
3. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合 DNA 时,大吸收光谱在 471nm,结合 DNA 时的大吸收光谱在 500nm,大发射光谱在530nm。
其他注意事项:
1. 如果使用 iCycler,可以不加入 FAM。
2. 如果使用 Roche LightCycler 的玻璃毛细管进行 PCR,需加入终浓度为 0.5mg/mL的自备 BSA。