2X染料法荧光定量PCR Mix

2X染料法荧光定量PCR Mix

产品及特点本产品是基于荧光染料检测的即用型 PCR 试剂盒，可以对靶片段进行实时定量 PCR分析（quantitative PCR、qPCR）。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2及新型荧光染料 DNAgreen 等所有实时定量 PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量 PCR 反应和 HRM 分析，具有广泛的用途。

1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行实时定量 PCR 实验和 HRM（HighResolution DNA Melt Curve Analysis）分析。而基于 SYBR Green I 和 LC Green染料的 qPCR mix 则不能同时用于上述两种实验。

2. 使用第三代饱和型荧光染料，信号强，不会抑制 PCR 反应。

3. 快捷，即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。

4. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能检测到浓度为50 拷贝/mL 的靶分子。
规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装 塑料袋包装 
2×SYBR qPCR MagicMix 90408 1 mL（棕色盖） 1 mL×6
使用手册 90408sc 1 份 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存, 保存期限为 6 个月。

自备试剂 DNA 模板、引物、超纯水。

使用方法 

1. 以 20 uL 的 qPCR 反应体系为例：在一干净的 PCR 管中，加入下列成分：反应体系成分 20 uL 体系 终浓度

2×SYBR qPCR MagicMix 10 uL 1×自备引物一 a x uL 0.1-0.5 uM自备引物二 a x uL 0.1-0.5 uM自备模板 a x uL自备 ROXb 2 uL （可以不加）补超纯水到 20 uL放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 并在退火或延长步骤中记录荧光信号。

注意：

a) 通常引物浓度以 0.2 μM 可得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考；通常 DNA 模板的量以 10-100 ng 基因组 DNA 或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定佳的模板使用量。

b) ROX 校正染料：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三种型号的荧光PCR 仪器，则需用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900，ROX的佳浓度为1×（即在每20 uL 反应体系中加2 uL 10×ROX）。对ABI 7500，ROX 的佳浓度为 0.05-0.1×（每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可将 10×ROX 稀释到 1×，然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX会在溶解曲线中产生噪音，因此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference

Dye”中的“ROX”选项取消打勾，然后重新分析数据。对 于 iCycler IQ， MJ Opticon ，MJ Chromo4 ，MX3000， MX4000,RotorGene3000，RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光 PCR仪器，ROX 不是必须的，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

2. 循环步骤：根据扩增子的性质和仪器性能，从以下三个过程中任选一个进行扩增。

A：两步快速循环法：适用于引物 Tm 值设计为 60℃的反应循环步骤 温度 时间 循环数酶活化 95℃ 10 min 1

变性

退火&延伸

95℃

60℃

15 s

1 min

35-40

注意：本产品所采用的热启动酶须在预变性 95℃、10 min 条件下实现酶的活化。退火温度请以 60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。

B：三步快速循环法：适用于延伸步骤温度高于退火步骤的 PCR（长引物 PCR）

循环步骤 温度 时间 循环数

酶活化 95℃ 10 min 1

变性

退火

延伸

95℃

56-64℃d

72℃e

10 s*

30 s

32 s

35-40

注意：

a) 退火温度：建议采用两步法 PCR，退火温度 60℃进行反应。若提高反应特异性，可提高退火温度，以 60-64℃作为设定范围的参考。若因使用 Tm 值较低的引物等原 因，得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法 PCR 扩增，三步法的退火温度请以 56℃-64℃的范围作为设定参考。延伸温度：延伸温度设为 72℃通常可以提高扩增效率。但是，对于 AT 含量大于 70%的扩增子来说，延伸温度设为 60℃为宜。

C：通用循环法：这种循环方法适用于几乎所有的荧光 PCR 仪，也适用于用快速循环法不能扩增的模版。

循环步骤 温度 时间 循环数

酶活化 95℃ 10 min 1变性

退火&延伸

95℃

60℃

15 s

60 s

35-40

3. 数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在没结合 DNA 时，大吸收光谱在 471nm，结合 DNA 时的大吸收光谱在 500nm，大发射光谱在530nm。

其他注意事项：

1. 如果使用 iCycler，可以不加入 FAM。

2. 如果使用 Roche LightCycler 的玻璃毛细管进行 PCR，需加入终浓度为 0.5mg/mL的自备 BSA。