超级杂交液(原位杂交用)
产品及特点
原位杂交是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体;一个细菌;更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段,在适宜的条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或NA-RNA 双键分子,应用带有标记的(有放射性同位素,如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交,然后可用放射自显影等方法予以显示,在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位;用原位杂交技术,可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性,可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。本产品为公司开发的即用型原位杂交专用核酸杂交液。既可以用于RNA原位杂交、DNA原位杂交,也可以用于FISH原位杂交等试验。
运输及保存 低温运输和-20℃保存、有效期一年。
自备试剂 盖玻片、多聚甲醛等
![QQ图片20191121152700.png QQ图片20191121152700.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201911/uepic/6fb646fa-010f-459f-8b5f-b352f7bf1a9f.jpg)
使用方法 以检测 mRNA 序列为例。培养细胞和冰冻切片
1. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES。切片厚度 10-20μm。
2. 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为 37℃和 5%的 CO2,所用培养基为 Dulbecco 基础培养基。细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗 2分钟×3 次。
3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为 4%多聚甲醛/0.1 MPBS (PH7.2-7.6),含有 1/1000 DEPC。室温固定 20--30 分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存 2 周以上。
4. 30%H2O2 1 份+纯甲醇 50 份混合,室温处理 30 分钟。蒸馏水洗涤 3 次。
5. 暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化 5—120 秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS 洗 3 次×5 分钟。蒸馏水洗 1 次。
6. 后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为 1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有 1/1000 DEPC。室温固定 10 分钟。蒸馏水洗涤 3次。
7. 预杂交:湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片加 20μL 预杂交液(提前加入鲑鱼精 DNA,终浓度为100ug/ml)。恒温箱 38-42℃2—4 小时。吸取多余液体,不洗。
注:靶 DNA 的变性
DNA-DNA 杂交检测中,在杂交前需要增加靶 DNA 的变性步骤(对 mRNA的原位杂交无需此步)。样品 DNA 的变性可能会造成样品形态学的部分破坏,此步是实验中需要优化的一个步骤。实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得条件。可以将探针的变性和样品 DNA 变性同步进行:将样品和探针溶液加盖盖玻片,置于烘箱 80℃变性 ,处 理 5-10 min,后冷却至 37℃进行杂交。
8. 杂交——按每张切片 20μL 杂交液(探针浓度约为 1ng/ul;杂交液提前加入鲑鱼精 DNA,终浓度为 100ug/ml),加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱 38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9. 杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的 2×SSC 洗涤 5 分钟×2 次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复 0.2×SSC 洗涤 15 分钟×1-2 次)。
10. 滴加封闭液:37℃30 分钟。甩去多余液体,不洗。
11. 根据探针标记物,选择相应显色方法显色、复染,脱水、封片。
12. 结果观察。
石蜡切片
如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6),含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm 的小块,固定 1 小时即可,较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间30-40 分钟,一般不要超过 1 小时。
1.常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8μm。
2.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或 APES。
3.石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1 份+蒸馏水 10 份混合,室温 5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 3 次。
4.暴露 mRNA 核酸片段:切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化 3--30 分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间,例如 5 分钟,10 分钟,20 分钟,30 分钟。以找到消化时间。原位杂交用 PBS 洗 3 次×5分钟。蒸馏水洗 1 次。
5. 其余步骤和冰冻切片 6-11 步相同。
6. 结果观察。
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