肠出血性大肠杆菌O157核酸检测试剂盒(恒温荧光法)
肠出血性大肠杆菌 O157 核酸检测试剂盒(恒温荧光法)
◆ 产品说明
致病菌检测系列基于独特的恒温荧光检测技术,可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核
酸片段进行扩增,仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化,自动判读结果。本产品用于肠出血性大肠杆菌 O157
的检测。检出限为 10
3 CFU/ml。
◆ 产品组成( 48 测试)
试剂 含量
A-O157-I 1200μL × 1 支
B-I 55μL × 1 支
C-I 1200μL × 1 支
NG-I 50μL × 2 支
PG-O157-I 50μL × 1 支
◆ 适用仪器
Dhelix 1610、Dhelix 3210、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308c 等恒温荧光检测仪,ABI 7500,LightCycler480,
CFX 96 等荧光 PCR 仪。
◆ 自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL 或 2.0mL 离心管;②灭菌 0.2mL PCR 管或八联管;③冰盒;④移液器(0.5-10μL,10-100μL,
100-1000μL)及配套灭菌吸头;⑤离心机;⑥涡旋混匀器;⑦金属浴
◆ 注意事项
1.本试剂检测灵敏度高。为了防止污染,实验要分区操作。
1)一区:试剂准备区。
2)第二区:样本制备区。
3)第三区:模板添加区。
4)第四区:扩增及产物分析区。
★ 分区之间好进行物理性隔离,避免人为因素造成的污染。
2.实验过程中穿戴工作服和乳胶手套,不同区域独立使用工具,需更换手套和实验服。
3.严格按照操作步骤操作,试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。
4.反应液中的成分对光敏感,应避光保存。试剂使用前要完全解冻,但应避免反复冻融,推荐使用前离心 30
秒,并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。
5.反应结束后,扩增管请置于密封袋内丢弃,当日清理,开盖易造成气溶胶污染,禁止开盖。
6.不同批号试剂请勿混合使用,在有效期内使用。
7. 检出限为 10
3 CFU/ml 是以 1 ml 10
3CFU/ml 增菌液离心后收集菌体再提取的细菌基因组 DNA 作为模板。
◆ 样品处理
参照 《GB/T 4789.36-2008 食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 检验》中的 5.1 处理样品,对
样品进行前增菌,制备的菌液保存待用。
样品采集后应尽快检验。若不能及时检验,可在 2℃~4℃保存 18h。以无菌操作取检样 25g(ml)加入到含有
225ml mEC+n 肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质 1min~2min;或放入盛有 225ml mEC+n 肉汤的均质杯
中,8000 rpm/min~10000 rpm/min 均质 1min~2min, 于 36 ℃±1℃培养 18h~24h。
详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。
◆ 实验操作
请于-20℃条件下保存,有效期 12 个月
SM-011051M-A02
2
将试剂完全解冻,各组分离心 30s。
1. 试剂配制(试剂准备区,放置于冰盒中进行):
若有 N 个待检样品,则参照下表,按照 N+2 个数量计算各组分用量(N 个待检样品+1 个阴性对照+1 个阳性
对照),将反应液置于 0.6ml 或者 1.5ml 离心管中,涡旋混匀,离心 30 秒,分装于 0.2ml PCR 管中,并向每管加入 1
滴 C-I(约 20μl)。
试剂 使用量
A-O157-I 22×(N+2)μL
B-I 1×(N+2)μL
反应液总体积 23×(N+2)μL
2.模板制备(样本制备区)
建议使用试剂配套细菌组 DNA 提取系列产品,具体过程详见产品说明书。
3.添加模板(模板添加区,放置于冰盒中进行)
在步骤 1 中已含有反应液的 PCR 管中加入 2μL 模板,顺序为 NG-I、待测样品模板、PG-O157-I。涡旋混匀
30s,离心 1min,立即进行扩增反应。
4. 扩增反应(扩增及产物分析区)
①恒温仪器 63℃条件下反应 45 min。
②若使用荧光定量 PCR 仪,则荧光基团选择 FAM,淬灭基团选择 None,将 63℃ 15 s,63℃ 45 s 作为一个
循环,于 63℃ 45 s 处收集荧光信号,45 个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
◆ 结果判定
①仪器自动判定结果,若显示“阳性”,则样品中含有肠出血性大肠杆菌 O157;若显示“阴性”,则样品中不含有
肠出血性大肠杆菌 O157 或含量低于检测限。
②在荧光定量 PCR 仪上,根据有无“S”型扩增曲线判定结果。若有“S”型扩增曲线,则样品中含有肠出血性大肠
杆菌 O157;若无“S”型扩增曲线,则样品中不含有肠出血性大肠杆菌 O157 或含量低于检测限。
★ NG 反应管结果显示“阴性”,PG 反应管结果显示“阳性”,此次检测结果有效,否则无效。如重复检测结果仍为无效,请与技
术支持人员联系。