Ar.A4 Electro感受态细胞
Ar.A4 Electroporation-Competent Cell 产品说明书
产品规格 (CAT#: LM1050)
Ar.A4 Electro: 50μl/支
pK7WGF2(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期): -80℃(12个月)
Ar.A4 Electro感受态细胞基因型
Agrobacterium rhizogenes(kanR ) Ar A4 Ri(agropine type)
Ar.A4 Electro感受态细胞产品说明
发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌,它能够感染
大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。Ar.A4发根农杆菌菌株含有农杆碱型Ri质粒,具有广
泛的宿主范围(玉米,烟草,胡萝卜,甘草等),同时具有卡那霉素抗性。唯地生物开发的Ar.A4发根农杆菌
电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pK7WGF2质粒 (size:11876 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA;
经pK7WGF2-ZH质粒(size:40 kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。
Ar.A4 Electro感受态细胞常规操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充
分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟
充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1 μg质粒DNA(体积不大于6ul,最好用
试剂盒抽提,双蒸水溶解;转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀
,立即插入冰中,用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
3. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数为Biorad 推荐,使用者也可按所用
电转仪推荐的protocol操作),将电击杯从冰中拿出,吸水纸吸干外表面水份,快速放入电转槽中,启动电击,
电击完成快速插入冰中,加入1 ml无抗生素的TY,并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上,倒置放
于28℃培养箱培养2-3天
● 农杆菌相关抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧苄青霉素 (carb) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素 (kan) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
链霉素 (strep) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平 (rif) | DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
庆大霉素 (gent) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
氯霉素(cam) | 无水乙醇溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 34 mg/ml | 34 ug/ml |
常用农杆菌抗性: (R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 氯霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
Ar A4 | S | S | S | S | R |
MSU440 | S | R | S | S | S |
Ar Qual | S | R | S | R | S |
● TY配方(1L):
Tryptone 5g
Yeast extract 3g
补水到1L体积,完全溶解后,121度、20分钟高温灭菌
配制1M的氯化钙水溶液,121度、20分钟高温灭菌
每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。
若配制TY固体培养基,则加入15g 琼脂粉。
Ar.A4 Electro感受态细胞注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率
急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 电转感受态细胞中不可混入气泡,转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的
菌落,应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。
4. Ar.A4具有卡那霉素抗性,不可用于具有卡那霉素抗性质粒的转化。
![QQ图片20181128145241.png QQ图片20181128145241.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/79713afa-fd28-4b72-bcba-ac7e8d5df20d.jpg)
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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