LBA4404 Electro感受态细胞
LBA4404 Electroporation-Competent Cell 产品说明书
产品规格 (CAT#: AE1030)
LBA4404 Elec: 50μl/支
pCAMBIA2301(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期): -80℃(12个月)
LBA4404 Electro感受态细胞基因型
Ach5 (rifR) Ti pAL4404 (strepR) Octopine
LBA4404 Electro感受态细胞产品说明
LBA4404菌株为Ach5型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404,此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。 pAL4404型Ti质粒含有筛选标签:strep,赋予LBA4404菌株链霉素抗性,适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作。唯地生物开发的LBA4404电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒 (size:11633 bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA;经pCAMBIA2301-ZH质粒 (size:40 kd)检测转化效率可达103 cfu/μg DNA。
LBA4404 Electro感受态细胞操作方法
1. 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入0.01-1 μg质粒DNA(体积不大于6ul,感受态转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200 μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。
3. 启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此参数为Biorad 推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700 μl无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天
(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。
备注
1、农杆菌相关抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧苄青霉素(carb) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素(kan) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
链霉素(strep) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平(rif) | DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
庆大霉素(gent) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 庆大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S
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3、LB及YEB配方:
component | LB(液体)/L | LB(固体)/L | component | YEB(液体)/L | YEB(固体)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 调PH到7.0 | 调PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | - | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
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| NaOH | 调PH到7.0 | 调PH到7.0 |
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| Agar | - | 15 g |
注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif则转化效率降低到1/2。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失,但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素,Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。
![QQ图片20181128145241.png QQ图片20181128145241.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/79713afa-fd28-4b72-bcba-ac7e8d5df20d.jpg)
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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