GV3101(pSoup-p19)感受态细胞
GV3101(pSoup-p19) Chemically Competent Cell 产品说明书
产品规格 (CAT#: AC1003)
GV3101(pSoup-p19): 100μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存条件(保质期): -80℃(12个月)
GV3101(pSoup-p19)感受态细胞基因型
C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pSoup-p19-tetR)
GV3101(pSoup-p19)感受态细胞产品说明
p19蛋白来源于番茄丛矮病毒,可抑制宿主对外源基因的RNA沉默效应,提高异源基因转录本的稳定性,进而促进异源蛋白的表达,广泛应用于转基因植物及烟草叶片,拟南芥叶片,番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。GV3101菌株为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 质粒含有筛选标签:gent,赋予GV3101菌株庆大霉素抗性;在GV3101菌株中转入help质粒:pSoup-p19即为GV3101(pSoup-p19)菌株,可帮助pGreen,62SK,pGs2等质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tet)抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。本公司生产的GV3101(pSoup-p19)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>103 cfu/μg DNA。
GV3101(pSoup-p19)感受态细胞操作方法
1. 取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。
2. 每100 μl感受态加入0.01-1 μg质粒DNA(转化效率较高,第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量),用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。
3. 加入700 μl无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。
4. 6000 rpm离心一分钟收菌,留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50 μg/ml kan 时,28℃培养48 h即可;平板中同时加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 时,需28℃培养60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 则需要28℃培养72-90 h)。
GV3101(pSoup-p19)感受态细胞注意事项
1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量,本公司生产的GV3101(pSoup-p19)化学转化感受态细胞具有四环素抗性,但在转入目标质粒涂板筛选阳性克隆时,只需加入目标质粒抗性的抗生素,不加四环素。
3. 平板上阳性克隆密度过大时,由于营养不足,阳性克隆生长变慢,菌落变小,为了获得大的菌落,应减少质粒用量。
4. 利福平浓度不应高于25 μg/ml,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。
5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低 (可以忽略)。
备注
1、农杆菌相关抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧苄青霉素(carb) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素(kan) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
链霉素(strep) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平(rif) | DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
庆大霉素(gent) | 双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株 | 羧苄青霉素(carb) | 链霉素(strep) | 利福平(rif) | 庆大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
3、LB及YEB配方:
component | LB(液体)/L | LB(固体)/L | component | YEB(液体)/L | YEB(固体)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 调PH到7.0 | 调PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | - | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
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| NaOH | 调PH到7.0 | 调PH到7.0 |
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| Agar | - | 15 g |
![QQ图片20181128145241.png QQ图片20181128145241.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/79713afa-fd28-4b72-bcba-ac7e8d5df20d.jpg)
同一批感受态细胞,用含目的片段的T载体质粒转化(阳性对照)能长出密密麻麻的菌落,而用另一种载体和目的片段的连接产物转化,却一个菌都没长出来,重复了三次都这样。请问这是感受态细胞的制作不过关,还是连接出了问题?哪个可能性大些?
答:应该是连接的问题。所有连接反应建议同时转化酶切后的质粒作为另一个阴性对照,确定酶切是否完全。同时连接前请确定质粒和片段浓度达到最小连接量的要求。
感受态细胞放到-80冰箱了有半年了,还能用来转化质粒吗?
答:如-80冰箱储存过程中没有发生冻融的情况,是可以用来转化的,但是由于冻存时间过长,转化效率会有所下降,如果用于普通的质粒重转或TA克隆等高效连接体系也是可以的,如珍贵的样品请选用较为新鲜的感受态细胞。
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