DUOX2试剂盒;大鼠双氧化酶2(DUOX2)ELISA试剂盒适用于以下样本的测试:血清、血浆- 组织匀浆 –腹水 –细胞培养上清
产品名称:大鼠双氧化酶2(DUOX2)ELISA试剂盒
简称:DUOX2试剂盒
规格:96T/48T
检测范围:0.156-10ng/mL
检测限:0.058ng/mL
1.实验原理:本试剂盒采用竞争法检测样本中大鼠双氧化酶2(DUOX2)的含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本,再加入生物素标记的识别抗原,在37℃下孵育30min,两者与固相抗体竞争结合形
成免疫复合物,经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原,然后加入亲和素-HRP,在37℃下孵育30min,亲和素-HRP与生物素抗原结合,洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色,随后在酸的作用下转化成黄色,在450nm波长下有吸收峰,吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。
2.试剂盒内容及其配制
![图片3.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/c43de137-d750-4981-bbaf-d301631a11a1.jpg)
3.试剂准备
a.使用前所有试剂应置于室温平衡至少30分钟。
b.本试剂盒可以直接加样,如浓度过高,可以进行适当比例的稀释(推荐2-5倍稀释),计算时应将结果乘以稀释的倍数。
c.洗涤液为25倍浓缩液,使用前将所有洗涤液倒入500ml或1L的烧杯中,用双蒸水定容到500ml即为工作液。
d.标准品的稀释:先用标准品/样品稀释液将标准品冻干粉定容到150μl,然后漩涡混匀30秒即为标准品原液(24小时内用完)。DUOX2试剂盒;大鼠双氧化酶2(DUOX2)ELISA试剂盒取5支干净的Eppendorf管,每管加150μl的标准品稀释液,分别标记上160ng/L,80ng/L,40ng/L,20ng/L ,10ng/L .取150μl标准品原液加入标记160ng/L 的管中,混匀后同样取出150μl,加入下一管,以此类推直至最后一管。零孔:直接加标准品/样品稀释液。(见下图)
![图片2.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/7ad8d6da-31be-4e98-a1dc-99fedef6a829.jpg)
e.生物素抗原的稀释:抽取生物素抗原稀释液1ml到浓缩型生物素抗原中,漩涡混匀15秒至冻干粉完全溶解,然后将所有液体移入稀释液瓶中,再次漩涡混匀30秒即为生物素抗原工作液。
f.亲和素-HRP的稀释:低速离心(使浓缩液全部沉到管底),将浓缩亲和素-HRP全部移入相应稀释液中然后漩涡混匀30秒即为亲和素-HRP工作液。
4.洗板方法
a.手工洗板:先洗去酶标孔中的的液体,在吸水纸上拍干,然后每孔加入300μl稀释好的洗涤液,轻轻摇晃30秒,然后甩掉,在吸水纸上拍干,重复4-5次。
b.洗板机洗板:洗板机洗板比较便捷,但应操作熟练后使用。
5.性能参数:
a.批内差:CV<10%
b.批间差:CV<12%
c.灵敏度:1ng/L
d.保存: 2-8℃
e.规格: 96T/盒
f.有效期: 6个月(2-8℃)。
6.详细操作程序
a. DUOX2试剂盒;大鼠双氧化酶2(DUOX2)ELISA试剂盒使用前请先将试剂盒在室温下平衡半小时。
b. 空白孔不加样,只加显色剂A,B和终止液用于调零。
c. 标准品孔:每孔加入稀释好的标准品50μl,零孔加入标准品/样品稀释液50μl,然后加入生物素抗原工作液50μl(零孔必须要做,并将其作为标曲的最后一个点)。
d. 样品孔:加入样品50μl(推荐直接加样,浓度高可以用样品稀释液稀释2-5倍),然后加入生物素抗原工作液50μl。
e. 轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。
f. 将25倍浓缩洗涤液用蒸馏水25倍稀释后备用。
g. 第一次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
h. 加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中,轻轻摇晃,盖上封板膜,37℃培养箱中孵育30min。
i. 第二次洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
j. 显色:每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟。
k. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).
l. 测定:以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后10分钟以内进行。
m. 计算:DUOX2试剂盒;大鼠双氧化酶2(DUOX2)ELISA试剂盒根据浓度和OD值算出标准曲线的回归方程,建议用专用计算软件进行计算,推荐使用ELISAcalc进行计算,拟合模型选用logistic曲线(四参数)。标曲示意图如下:
浓度 | Blank | S5 | S4 | S3 | S2 | S1 | S0 |
OD值 | VB | V5 | V4 | V3 | V2 | V1 | V0 |
校准值 | VB-VB | V5-VB | V4-VB | V3-VB | V2-VB | V1-VB | V0-VB |
![图片1.png](https://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/edc34703-516a-4af3-905f-d97ea63730e3.jpg)
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