dPCR用于新冠病毒核酸定量检测研究

dPCR用于新冠病毒核酸定量检测研究，Clin. Infect. Dis., 2020

摘要

近日，首都医科大学附属北京地坛医院张福杰教授团队与清华大学医学院郭永团队合作，比较了ddPCR与实时荧光定量PCR（RT-PCR）在新冠病毒检测中的应用，并利用ddPCR 评估了SARS-CoV-2病毒载量在不同样本中的差异以及在疾病进程中的动态变化，发现痰标本更能反应体内病毒复制水平，定量监测下呼吸道样本的病毒载量有助于评估疾病进程。该研究结果于3月28日在Clinical Infectious Diseases上发表。

研究背景

新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 作为一种以呼吸道感染为主的新病毒，短时间内爆发并迅速向世界各国蔓延。目前，我国及世界各国将定性核酸检测作为COVID-19病原学诊断的金标准，但在临床和流行病学高度疑似的病例中存在核酸检测阴性的问题以及确诊病人出院2周复查发现核酸“复阳”的报道，核酸检测在COVID-19诊断中的作用需要进一步研究。

方法与结果

该研究对来自76位确诊病人的323份样本（鼻拭子55、咽拭子134、痰116，尿14，血4）同时进行RT-PCR与ddPCR（图1）配对检测，发现95个RT-PCR检测阳性的样本ddPCR结果也为阳性，qPCR的Ct值与ddPCR的拷贝数高度相关，但有4例（2.5%）RT-PCR判断阴性的样本ddPCR检测为阳性，拷贝数处于11.3-20.7 copies/test，41例（61.2%）RT-PCR判断为N基因或ORF1ab 基因单阳的样本ddPCR为阳性，拷贝数处于11.1-123.2 copies/test。对比研究表明两种方法均可为COVID-19诊断提供较准确的结果，但ddPCR在低病毒载量的检测中更有优势且能给出样本中的病毒载量数值（图2）。

图1  ddPCR方法介绍

图2  RT-PCR与ddPCR在COVID-19确诊病人核酸检测中的一致性评价

利用ddPCR分析不同组织样本的病毒载量，发现痰标本的平均病毒载量(17429 ± 6920 copies/test) 显著高于咽拭子 (2552 ± 1965 copies/test, p < 0.001) 和鼻拭子 (651 ± 501 copies/test)，表明痰更能反应体内病毒复制水平。进一步用44位确诊病人的116份痰标本分析病毒载量在疾病进程中的变化，发现在疾病早期和进展期平均病毒载量显著高于恢复期（图3A）。因此，早期诊断并采取隔离措施有助于减少传播和控制疾病。另外，通过对2位临床表现和胸部CT提示进入恢复期的患者进行9天的动态观察，分别检测6次和7次痰标本，发现在核酸转阴之前较长时间处于无症状低病毒载量携带状态（图3B），提示这一阶段取样方法不当或采集上呼吸道样本极易出现检测“阴性”的结果，多次下呼吸道样本及不同方法的检测有助于提高灵敏度。

图3 痰标本病毒载量在疾病进程中的变化

目前，COVID-19尚无有效的抗病毒治疗药物，对于正在以及未来进行的抗病毒药物临床试验，ddPCR定量检测可能对药物疗效评价具有重要指导意义。

作者介绍

于凤婷、闫力婷、王楠为该研究的共同第一作者，张福杰和郭永为该研究的共同通讯作者。本项目的研究受到了首都医科大学附属北京地坛医院、新发突发传染病研究北京市重点实验室、清华大学等单位的支持。