应用 | 天然产物提取巧方法-高效制备香兰素

香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）（图 1）是天然香草的主要成分，是世界范围内使用最广泛和最重要的调味材料之一。
香兰素可以从热带香草兰(主要是 Vanilla planifolia Andrews) ¹的豆子或豆荚中提取、重组生产或合成。食品配方中使用的纯香兰素的来源可以通过其同位素特征²来区分。该方法可能需要先进行初步纯化。
在本研究中，使用香草的乙醇粗提物来对比VERITY® PLC 2050 系统与不同类型色谱柱配合使用的能力。在 HPLC 制备柱和 CPC PRO 上进行香兰素（Vanillin）的制备纯化。对比了两种技术所获取最终的香兰素纯度、溶剂消耗和进样量。

离心分配色谱(CPC)应用的优势

• 可从 6.3 g 粗提物获得 500 mg 的纯香兰素，并进一步同位素分析确认其特性。

• 制备型高效液相色谱法与离心分离色谱法在香兰素纯化方面的比较。

解决的问题

• 一套制备型液相系统 (PLC 2050) 可以同时适应制备高效液相色谱法和离心分离色谱法。
• 与制备高效液相色谱相比，离心分离色谱(CPC 250 PRO) 是复杂提取物处理的更佳选择。
• 大幅度减少溶剂消耗，降低成本和对环境的影响

材料和方法

系统

Gilson VERITY CPC 250 Pro 离心分配色谱仪(图 2)，或者Merck公司的制备HPLC 色谱柱Hibar 250 X 25, C18, 5μm (图 3) 连接到 Gilson PLC 2050 系统, 该系统配有一台 50 mL/min 的四元梯度泵，一台紫外检测器, 一台馏分收集器及配套的 Gilson Glider 软件。

HPLC分析是在LaChrom Elite HPLC (VWR)系统上进行的，这套HPLC系统配有波长范围200-800nm的二极管阵列检测器 (PDA)。

样品

粗提物首先进行HPLC分析 (表 1). 香兰素在rt = 9.9分钟出峰，280纳米处峰值面积为63.7%, (图 4)。通过外标对照品校正，粗提物种中香兰素的含量约为9% (w/w) 。提取物中大部分的分子没有被紫外检测到。

制备 28 g/L 的香兰素提取物溶液用于离心分离色谱进样，同时制备0.08g/L的低浓度样品用于制备HPLC，以避免进样压力过高。

方法

制备高效液相色谱与离心分配色谱所运行的方法分别详见表2和表3。当使用制备高效液相色谱时，进样90 mg的粗油，以20mL/min的流速等度洗脱。当使用离心分离色谱时，进样6.3 g的粗油，以30mL/min的升相模式洗脱。

结果和讨论

最终得到的制备色谱图如图 5 和图 6所示。两个色谱图中的蓝色区域代表收集的香兰素馏分。这些馏分进一步使用HPLC进行分析，在280nm下的检测结果如图7和图8所示。

两种技术都能获得纯度大于 99% 的香兰素（表 4）。 此外，使用 CPC 的回收率大于 91.8%（表 4）。 这表明 CPC 能够避免由于潜在的不可逆吸附而导致的样品损失。 在制备型 HPLC 中洗脱香兰素需要 500 毫升溶剂（图 5），而在 CPC 中洗脱香兰素仅需使用 360 毫升溶剂（表 4）。由此可以得出，每进样1 g的原料，制备型 HPLC 需要使用5.3升的溶剂，而 CPC只需要使用 0.1 升的溶剂。

本研究中由于制备型 HPLC的进样量低，无法得到回收的香兰素的质量和产率。

结论

PLC 2050 能够高效便捷地与 CPC 和 prep HPLC 色谱柱搭配使用，用来进行纯化工作。在本文中，通过对比CPC与HPLC制备柱，展现了CPC的优势（表 4）。与 prepHPLC相比，CPC溶剂消耗量更低且无需固定相（如二氧化硅），进样量更大，而纯化效率近似。 这些基于实验室级仪器得到的纯度，产量，产率等数据，可以放大并应用到工业级CPC （如Gilson VERITY 工业级CPC ）解决方案。

参考文献：
1.Vanillin; Walton N.J. and Al; Phytochemistry, 63, (2003), 505-515
2.Zietlow et. al. Journal of Agricultural and Food Chemistry 50(22):6271-5

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