继上篇《浅谈令人“爱恨交加”的Protein A亲和层析介质》(点击回顾)后,江必旺博士本期带我们了解影响Protein A层析介质的多种参数,供广大用户学习,也欢迎大家在评论区留言讨论。
Protein A亲和填料的关键考核要素
Protein A是用于抗体第一步分离纯化,其性能影响抗体生产的效率,成本,纯度等等,因此抗体厂家对Protein A 介质的要求较高。其关键点在Protein A 介质的载量,机械强度,耐碱性,使用寿命,纯度和回收率,配基脱落及HCP的残留及产品的质量和稳定供应等等。
介质载量:层析介质的载量是药厂选择的重要参数,载量越高,同样柱体积填料可以处理更多的抗体料液,生产效率也就越高。但Protein A 亲和填料载量与柱保留时间有关,一般情况是柱留时间越长,测试的载量越大,也就是说流动相速度越快载量越低,这主要是因为抗体在介质微球中的扩散速度受限造成的。抗体的纯化生产效率与流动相速度有关,速度越快生产效率越高,但速度越快载量越低,上样量越少,因此要平衡好载量和流速以达到最高生产效率。评估亲和介质载量要看,其载量是在什么样的流速下测试的,理想的介质是在高流速条件下具有较高的载量。这样有利于兼顾生产效率和产量;
抗体回收率和纯度:一般来说Protein A亲和层析介质用于抗体分离纯化回收率都比较高(一般都高于90%以上),回收率越高,成本越低。另外纯化后抗体的纯度也是药厂重点考虑的因素,Protein A 亲和层析往往是用于第一步捕获,一步亲和层析就可以把纯度提高到95%以上,通过第一步纯化后抗体纯度越高,后续精细分离的压力越小。抗体回收率和纯度往往更Protein A配基种类有关系,不同厂家采用的配基不同,会影响收率和纯度。
介质寿命及耐碱性:亲和层析介质比离子交换介质价格高很多,而且使用寿命又比离子交换介质短很多,使得亲和层析介质在抗体的纯化介质中占据80%成本。因此亲和层析介质的寿命是抗体厂家要考虑的另外一个重要参数。高效服役时间的长短会在一定程度上影响纯化的经济性,也能从某种程度上避免更换填料带来的潜在问题;另外药物生产过程中,氢氧化钠被广泛用于层析介质及系统的清洗、消毒及存储等过程。采用氢氧化钠再生可避免不同cycle间的蛋白及核酸的交叉污染,也可有效降低Bioburden。当浓度大于0.1M时,可有效灭活Murine Leukemia Virus等病毒,杀灭细菌及芽孢杆菌,降低内毒素水平。因此Protein A 亲和层析介质的耐碱性对其寿命及纯化抗体的质量具有重大意义。一般Protein A 亲和层析介质需要耐受0.5 M NaOH溶液清洗,且在经过100 Cycles清洗后,动态载量仍要维持在95%以上;
表1氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计
HIV | BVD | CPV | BHV | POL | SV-40 | MLV | ADV | ||
0.1M NaOH | Spike | 2.0×106 | 9.5×106 | 2.0×109 | 6.9×109 | 7.1×108 | 1.7×108 | 2.6×105 | 2.2×108 |
20min | 5.8×102 | 1.5×104 | 9.6×102 | 4.5×101 | 2.0×104 | 4.7×104 | 4.0×101 | 6.3×101 | |
60min | 5.8×102 | 2.7×104 | 5.0×103 | 4.5×101 | 2.1×103 | 2.0×104 | 4.3×101 | 2.9×101 | |
Inactivat(log10) | 3.5 | 2.5 | 5.6 | 8.2 | 5.5 | 3.9 | 3.8 | 6.9 | |
0.5M NaOH | Spike | 2.0×106 | 9.5×106 | 2.0×109 | 6.9×109 | 7.1×108 | 1.7×108 | 2.6×105 | 2.2×108 |
20min | 5.6×102 | 1.7×102 | 1.5×103 | 5.9×101 | 2.0×104 | 8.4×103 | 4.7×101 | 2.0×101 | |
60min | 6.7×102 | 2.7×102 | 5.0×103 | 5.9×101 | 6.2×103 | 1.0×103 | 5.5×101 | 2.2×101 | |
Inactivation(log10) | 3.5 | 4.7 | 6.1 | 8.1 | 5。1 | 6.2 | 3.7 | 7 | |
Note:病毒浓度检测采用组织细胞感染计量TCID50 |
大量的微生物如酵母细菌可干扰层析过程,同时可以造成筛板堵塞等问题,更重要的是微生物产生的内毒素和蛋白酶严重污染纯化料液。氢氧化钠可有效抑制、杀灭酵母及细菌等微生物。数据见下表。
表2 氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计
Organism | Conc.NaOH(M) | Time(hrs) | Temp. |
E.coli | 0.01 | 2 | 4/22℃ |
S.aureus | 0.1 | 1 | 4/22℃ |
C.albicans | 0.5 | 1 | 4/22℃ |
A.niger | 0.5 | 1 | 4/22℃ |
B.subtilis spores | 1 | 48 | 22℃ |
P.aeruginosa | 1 | 1 | 22℃ |
Note:细菌低于检测限度(<3Organisoms/ml)所需要的时间 |
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁成分,主要是类脂多糖,也被称作热源。注射药物中含有纳克级含量即可使人体产生寒颤,高热甚至休克等不良反应。GMP生产的各环节严格控制热源,层析过程也是重点监控步骤。采用氢氧化钠对层析系统及填料进行SIP可确保把热源含量降至最小。下图是不同浓度氢氧化钠对于内毒素的灭活效果。
机械强度:高机械强度的介质耐压性好,耐受更高的流速,从而提高生产效率,缩短纯化周期;另外高机械强度填料可装填更长柱子,从而提高批次处理量;高机械强度介质可以减少碎片避免筛板堵塞,降低压力;还有高机械强度的介质可以上高浓度,高粘度的样品;最后高机械强度有利于放大生产,越大的柱子,对介质机械强度要求越高,因此高机械强度的介质在大规模层析纯化过程中越不容易给压塌,可以确保生产的安全性。
Protein A层析介质除了要考虑载量,机械强度,耐碱性及寿命外,还要考虑Protein A的 脱落及内毒素的控制及生产的批次稳定性等。
下期,江必旺博士将为我们带来“Protein A 亲和层析介质的制备方法”干货文章,敬请期待。
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