2016/11/30 17:00
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萌发麦苗淀粉酶活力及水溶性蛋白含量的测定
一、研究背景及目的
酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂。大多数由蛋白质组成(少数为RNA)。能在机体中十分温和的条件下,高效率地催化各种生物化学反应,促进生物体的新陈代谢。生命活动中的消化、吸收、呼吸、运动和生殖都是酶促反应过程。酶是细胞赖以生存的基础。
细胞新陈代谢包括的所有化学反应几乎都是在酶的催化下进行的。
因此,对酶的研究是十分重要的。通过对酶活性的测定,可以更好地了解生物体的代谢过程。
其中,淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,可以分成α-淀粉酶,β-淀粉酶等。α-淀粉酶既作用于直链淀粉,亦作用于支链淀粉,无差别地随机切断糖链内部的α-1,4-链。β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链。
根据其催化产物的特点和现有测定方法规定酶活力单位为:每分钟每克鲜重麦种所
催化产生的麦芽糖毫克数。
3,5-二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热,产生一种棕红色的氨基化合物,在一定的浓度范围内,棕红色物质颜色的深浅
程度与还原糖的量成正比。因此,我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖,可用该方法对其含量进行测定。
本次实验的目的在于通过实验过程,理解淀粉酶测定的原理,熟悉实验操作,掌握实验方法。
蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子,它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质,对生物来说十分重要。目前有四种蛋白质含量测定方法:凯氏定氮、
Folin-酚法、染料结合法、紫外法,最常用的是后三种。本次实验选择通过Folin-酚法测定蛋白质含量。这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,
由于其试剂乙的配制较为困难,近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。
二、实验原理
该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件,保持其处于最适条件,测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。以及通过化学反应使得蛋白质具有特异光吸收,再通过比色法测定蛋白质含量。
该实验的理论基础为:
(1)酶的性质:淀粉酶是蛋白质,在一定的条件下会发生钝化,可利用此性质将体系中的
非目标酶类钝化,从而测出目标酶类的活力;
(2)3,5-二硝基水杨酸法:
3,5-二硝基水杨酸法是一种对还原糖定量测定的方法。
还原糖和碱性二硝基水杨酸试剂一起共热,产生一种棕红色的氨基化合物,在一定的浓度范围内,棕红色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比。因此,我们可以测定样品中还原糖以及总糖的量。麦芽糖是还原性糖,可用该方法对其含量进行测定。
具体反映为:
在加热、碱性条件下:3,5-二硝基水杨酸(黄色)+还原糖—→3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)+糖酸;
(3)比色法原理:朗伯—比尔定律(当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物
质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比)。
三、仪器试剂
1、仪器设备:DK-S24型40℃水浴锅;22列八孔型70℃电热恒温水浴锅;722型光栅分光光度计;DCL-2000 DY型电磁炉
2、主要实验器皿:
50ml容量瓶,100ml容量瓶,研钵一套,具塞刻度试管若干,试管若干,烧杯。
3、试剂:
(1)麦芽糖标准液(1mg/ml);
(2)pH5.6的柠檬缓冲液:
A液(称取柠檬酸20.01克,溶解后定容至1L)
B液(称取柠檬酸钠29.41克,溶解后定容至1L)
取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液;
(3)3,5-二硝基水杨酸溶液(称取3,5-二硝基水杨酸1.00克,溶于20ml 1M氢氧化钠中,加入50ml蒸馏水,再加入30克酒石酸钠,待溶解后,用蒸馏水稀释至100ml,盖紧瓶塞,勿使二氧化碳进入)
; (4)麦芽糖标准液(称取0.100克麦芽糖,溶于少量蒸馏水中,小心移入100ml容量瓶中,用蒸馏水定容到100ml);
(5)0.4M NaOH;
(6)试剂甲:
(A)
10克
Na2CO3,2NaOH和0.25克酒石酸钾钠
(KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。
(B)
0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与份(B)混合,即为试剂甲。(7)试剂乙:
在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25
克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克
硫酸锂(,50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至
1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。
(8)牛血清蛋白标准溶液(250μg/ml)。
4
、实验材料:
萌发的小麦种子。
四、实验步骤
(1)酶液的制备(蒸馏水浸提):
称取2克萌发的小麦种子(芽长一厘米左右),置于研钵中加少量石英砂,蒸馏水作为匀浆液,研磨成匀浆,转移到50ml容量瓶中至40ml左右,浸提15-20分钟,用蒸馏水定容到度,混匀后3500转/分离心20分钟,取出上清液备用(初始酶液)。
(2α
-淀粉酶活性的测定:
A.
取试管4支,注明两支为对照管,两支为测定管。
B.于每个管中各加入酶提取液1毫升,在70℃恒温水浴中(水浴温度的变化不应超过±0.5℃)准确加热15分钟,取出后迅速在水浴中彻底冷却。
C.
在试管中各加入1ml pH5.6柠檬酸缓冲液。
D.将测定管和对照管置于40℃(±0.5℃)恒温水浴中准确保温15分钟后,向两支对照管中各加入4ml 0.4MNaOH,再向各管分别加入40℃下预热的淀粉溶液2ml,摇匀,立即放入
40℃水浴中准确保温5分钟后,向两支测定管分别迅速加入4ml 0.4NaOH,然后准备下步糖的测定。
(3)α-淀粉酶及β-淀粉酶总活性的测定:
取酶液5ml,放入100ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度。混均后,取4支试管,2支为对照管,2支为测定管,各加入稀释后酶液1mlpH5.6柠檬酸缓冲液1ml,以下步骤重复α-淀粉酶测定的第
D的操作。
(4)麦芽糖的测定:
a.标准曲线的制作
取15ml具塞刻度试管7支,编号,分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml)0、0.1、.3、0.5、
0.7、0.9、1.0毫升,然后将各管用蒸馏水准确补充到1.0毫升,摇匀后再加入3,5-二硝基水杨酸1毫升,摇匀,在沸水浴中准确保温5分钟,取出冷却,用蒸馏水稀释到15毫升,混
均匀后用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录消光值,以消光值为纵坐标以麦芽糖
含量为横坐标绘制标准曲线。
b.
样品的测定
取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各
1
毫升,分别放入15毫升具塞刻度管中,在加入1毫升,3,5-
二硝基水杨酸试剂混匀,置于沸水浴中准确煮沸5分钟,取出冷,用蒸馏水稀释至15毫升,混匀,用分光光度计在520nm波长下进行比色,记录消光值,根据标准曲线,进行结果计算。
(5)水溶性蛋白的测定
A.
标准曲线的测定:取6支大试管分别加入0,.2
,
0.4
,
0.6
,
0.8
,
1.0
毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,迅速混匀,于室温(2025℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂),同样立即混匀。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于650nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制出标准曲线。
B.
样品的测定
取酶液2ml,加入6ml蒸馏水,作为待测液。按上述方法进行操作,同时进行。根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
(6)结果计算
α-淀粉酶活性(毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1)=
=
毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1 (α-+β-)淀粉酶总活性(毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1
)
=
=
毫克麦芽糖·克-1鲜重·分钟-1 A
—α-淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度
A’—
α-淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度
B
—
α
-
及
β
-
淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度
七、结论与展望
通过该实验,我们得到如下结论:
(1)(α-+β-)淀粉酶总活性远高于α-淀粉酶的活性;
(2)其机理尚不清楚,需要通过进一步的实验进行探究;
(3)小麦种子中水溶性蛋白的含量为2.16%; (4)该实验的总体思路正确,可以得出可靠结果。
针对以上结论,
本次实验验证了测定酶活力的总体思路,
为今后的实验做出了指导。
另
外,要进一步验证实验中出现的问题,可以钝化
α
-
淀粉酶,单独测定
β
-
淀粉酶的活性,同
时测定(
α
-+
β
-
)淀粉酶总活性。若
β
-
淀粉酶活性的确远高于
α
-
淀粉酶,则这两种淀粉酶
没有协同作用,否则它们就极可能存在相互作用。
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