2016/11/17 10:15
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植物组织中可溶性糖含量的测定
在作物的碳素营养中,作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有:
合成纤维素组成细胞壁;转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等;分解产物是其他许多有机物合成的原料,如糖在呼吸过程中形成的有机酸,可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸;糖类作为呼吸基质,为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用,所以是营养中最基本的物质,也是需要量最多的一类。
Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖
一、原理
糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在一定范围内,颜色的深浅与糖的含量成正比,故可用于糖定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物,不但可以测定戊糖与己糖含量而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应),所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下,用蒽酮法可以一次测出总量,省去许多麻烦,因此,有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时,则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中,不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外,不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同,果糖显色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖显色更浅,故测定糖的混合物时,常因不同糖类的比例不同造成误差,但测定单一糖类时,则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ,故在此波长下进行比色。
二、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
任何植物鲜样或干样。
(二)试剂1. 80 %乙醇。
2. 葡萄糖标准溶液( 100 μg/mL ):准确称取 100 mg 分析纯无水葡萄糖,溶于蒸馏水并定容至 100 mL ,使用时再稀释 10 倍( 100 μg/mL )。
3 .蒽酮试剂:称取 1.0 g 蒽酮,溶于 80% 浓硫酸(将 98% 浓硫酸稀释,把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中) 1000 mL 中,冷却至室温,贮于具塞棕色瓶内,冰箱保存,可使用 2 ~ 3 周。
(三)仪器设备
分光光度计,分析天平,离心管,离心机,恒温水浴,试管,三角瓶,移液管(5 1
、
0.5 mL ),剪刀,瓷盘,玻棒,水浴锅,电炉,漏斗,滤纸。
三、实验步骤
1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品 0.5 ~ 1.0 g (或干样粉末 5 ~ 100 mg ),放入大试管中,加入 15 mL 蒸馏水,在沸水浴中煮沸 20 min ,取出冷却,过滤入 100 mL
容量瓶中,用蒸馏水冲洗残渣数次,定容至刻度。
2. 标准曲线制作取 6 支大试管,从 0 ~ 5 分别编号,按表 24-1 加入各试剂将各管快速摇动混匀后,在沸水浴中煮 10 min ,取出冷却,在 620 nm 波长下,用空白调零测定光密度,以光密度为纵坐标,含葡萄糖量 μg )为横坐标绘制标准曲线。
3 .样品测定
取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ,同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。
四、结果计算
式中: C ——从标准曲线查得葡萄糖量, μg 。V T ——样品提取液总体积 , mL 。
V 1 ——显色时取样品液量, mL 。 W ——样品重( g )。Ⅱ 苯酚法测定可溶性糖
一、原理
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理
是:糖在浓硫酸作用下,脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物,在10 ~ 100mg 范围内其颜色深浅与糖的含量成正比,且在 485 nm 波长下有最大吸收峰,故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定,方法简单,灵敏度高,实验时基本不受蛋白质存在的影响,并且产生的颜色稳定 160 min 以上。
二、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
新鲜的植物叶片。
(二)试剂
1. 90 %苯酚溶液:称取 90 g 苯酚( AR ),加蒸馏水溶解并定容至 100 mL ,在室温下可
保存数月。
2. 9 %苯酚溶液:取 3 mL 90 %苯酚溶液,加蒸馏水至 30 mL ,现配现用。
3.
浓硫酸(比重1.84 )。
4. 1 %蔗糖标准液:将分析纯蔗糖在 80 ℃下烘至恒重,精确称取 1.000 g ,加少量水溶解,移入 100 mL 容量瓶中,加入 0.5 mL 浓硫酸,用蒸馏水定容至刻度。
5. 100 μg/L 蔗糖标准液:精确吸取 1 %蔗糖标准液 l mL 加入 100 mL 容量瓶中,加蒸馏
水定容。
(三)仪器设备
分光光度计,电炉,铝锅,20 mL 刻度试管,刻度吸管5 mL 1 支、 mL 2 支,记号笔,吸水纸适量。
三、实验步骤
1 .标准曲线的制作取20 mL 刻度试管11 支,从0~ 10 分别编号,按表 24 – 2 加入溶液和水,然后按顺序向试管内加入 1mL 9 %苯酚溶液,摇匀,再从管液正面以 5 ~ 20 s 时间加入 5 mL 浓硫酸,摇匀。比色液总体积为 8 mL ,在室温下放置 30 min ,显色。然后以空白为参比,在 485 nm 波长下比色测定,以糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制标准曲线,求出标准直线方程。
2 .可溶性糖的提取
取新鲜植物叶片,擦净表面污物,剪碎混匀,称取 0.1 ~ 0.3 g, 共 3 份,分别放入 3 支刻试管中,加入 5 ~ 10 mL 蒸馏水,塑料薄膜封口,于沸水中提取 30 min (提取 2 次),提取液过滤入 25 mL 容量瓶中,反复冲洗试管及残渣,定容至刻度。
3 .测定
吸取 0.5 mL 样品液于试管中(重复 2 次),加蒸馏水 1.5 mL ,同制作标准曲线的步骤,按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液,显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量,计算测试样品中糖含量。
四、结果计算
可溶性糖含量(%) = 式中: C ——标准方程求得糖量, μg 。
V T ——提取液体积, mL 。
V 1 ——吸取样品液体积, mL 。
W ——组织重量, g 。
Ⅲ 3 , 5 –二硝基水杨酸比色法测定还原糖
一、原理
3 , 5 –二硝基水杨酸溶液与还原糖(各种单糖和麦芽糖)溶液共热后被还原成棕红色的氨
基化合物,在一定范围内,还原糖的量和棕红色物的颜色深浅的程度成一定比例关系。在
540 nm 波长下测定棕红色物质的消光度值,查标准曲线,便可求出样品中还原糖的含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
食用面粉。
(二)试剂
1. 1 mg/mL 葡萄糖标准液:准确称取 100 mg 分析纯葡萄糖(预先在 80 ℃烘干至恒重),
置于小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,定量转移到 100mL 的容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,摇匀,置冰箱中保存备用。
2. 3,5 - 二硝基水杨酸试剂: 3,5 - 二硝基水杨酸 6.3 g , 2 mol/L 的 NaOH 溶液 262 mL,加到
500 mL 含有 185 g 酒石酸钾钠的热水溶液中,再加 5 g 结晶酚和 5 g 亚硫酸钠,搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000 mL ,贮于棕色瓶中备用。
(三)仪器设备
离心机,电子天平,分光光度计,大离心管或玻璃漏斗, 100 mL 烧杯, 100 mL 三角瓶,刻
度试管,刻度吸管 1 、 2 、 10 mL ,沸水浴,容量瓶。
三、实验步骤
1. 制作葡萄糖标准曲线
取 7 支具有 25 mL 刻度的刻度试管,编号,按表 24–3 所示的量,精确加入浓度为 1 mg/mL
的葡萄糖标准液和 3,5 –二硝基水杨酸试剂将各管摇匀,在沸水浴中加热 5 min ,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温,再以蒸馏水定容至 25 mL 刻度处,用橡皮塞塞住管口,
颠倒混匀(如用大试管,则向每管加入 21.5 mL 蒸馏水,混匀)。在 540 nm 波长下,用 0 号管调零,分别读取 1 ~ 6 号管的消光值。以消光值为纵坐标,葡萄糖毫克数为横坐标,绘制标准曲线,求得直线方程。
2. 样品中还原糖的测定
(1 )样品中还原糖的提取
准确称取 3 g 食用面粉,放在 100 mL 的烧杯中,先以少量蒸馏水调成糊状,然后加 50 mL 蒸馏水,搅匀,置于 50 ℃恒温水浴中保温 20 min ,使还原糖浸出。离心或过滤,用 20 mL
蒸馏水洗残渣,再离心或过滤,将两次离心的上清液或滤液全部收集在 l00 mL 的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,混匀,作为还原糖待测液。
(2 )显色和比色取 3 支 25 mL 刻度试管,编号,分别加入还原糖待测液 2 mL , 3 , 5 –二硝基水杨酸试剂 1.5 mL ,其余操作均与制作标准曲线相同,测定各管的消光值。分别在
标准曲线上查出相应还原糖毫克数,计算还原糖百分含量。
四、结果计算
式中:C ——标准曲线方程求得的还原糖量, mg 。
V T ——提取液的体积, mL 。V 1 ——显色时吸取样品液体积, mL 。
W ——样品重, g 。
Ⅳ斐林试剂比色法测定还原糖
一、原理
植物组织中的可溶性糖可分为还原糖(主要是葡萄糖和果糖)和非还原糖(主要是蔗糖)两类。还原糖具有醛基和酮基,在碱性溶液中煮沸,能把斐林试剂中的Cu 2+ 还原成Cu + ,使蓝色的斐林试剂脱色,脱色的程度与溶液中含糖量成正比,在 590 nm 波长下比色测定吸光度,查标准曲线,即可计算出所测样品中还原糖的含量。本方法也可用于测定蔗糖及总糖含量。
二、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
新鲜植物样品或烘干粉碎过的植物样品。
(二)试剂
1. 斐林试剂 A 液: 40 g CuSO 4 · 5H 2 O 溶解于蒸馏水定容至 1000 mL 。
2. 斐林试剂 B 液: 200g 酒石酸钾钠( KNaC 4 H 4 O 6 · 5H 2 O )与 150g NaOH 溶于蒸馏水中,并定容至 1000 mL 。
A 、 B 两液分别贮存,使用前等体积混合。
3. 0.1 %葡萄糖标准液:取 80 ℃下烘至恒重的葡萄糖 0.1000 g ,加蒸馏水溶解,定至 100 mL
。 4. 0.1mol/LNaOH 。
5. 甲基红指示剂: 0.1 g 甲基红溶于 250 mL 60 %乙醇中。
6. 10 % Pb(Ac) 2 。
7. 饱和 Na 2 SO 4 。
三)仪器设备
分光光度计,分析天平,离心机,水浴锅,具塞刻度试管,刻度吸管,容量瓶,研钵。
三、实验步骤
1 .
标准曲线的制作取 7 支试管,按表 24 – 4 分别加入各溶液。
将以上各管混合后加塞,于沸水浴中加热15 min 。取出后自来水冷却,1500 /min
离心15 min 。取上清液,用分光光度计在 590 nm 波长下比色,以蒸馏水作对照,读取吸光度。用空白管的吸光度与不同浓度糖的各管的吸光度之差为横坐标,对应的糖含量为纵坐标,绘制标准曲线。
2. 样品中还原糖的提取
取新鲜的植物样品洗净、擦干、剪碎,称取3.00 g ,放入研钵中研磨至糊状,用水洗入大试管中。体积为 10 ~ 15 mL 时,加 2 ~ 3 滴甲基红指示剂,如呈红色,可用 0.1 mol/L 的
NaOH 中和至微黄色。若用风干样品,可称取干粉 3.00 g ,先在烧杯中用少量水湿润,然后用水洗入 250 mL 容量瓶中,如显酸性,可用上法中和。
将大试管置于 80 ℃的恒温水浴中保温 30 min ,其间摇动数次,以便将还原糖充分提取出来。对含蛋白质较多的样品,此间可加 10 % Pb(Ac) 2 ,除去蛋白质,至不再产生白色絮状沉淀时,加饱和 Na 2 SO 4 除去多余的铅离子。 30 min 后取出冷却,将提取液全部转入 100 mL
容量瓶中。定容至刻度,摇匀后过滤待测。
3. 样品测定
吸取 6 mL 待测液,加 4 mL 斐林试剂,其他操作与标准曲线相同,在 590 nm 波
长下读取吸光度。以不含样品的空白管的吸光度减去样品管的吸光度,在标准曲线上查出糖含量。
四、结果计算
式中: C ——标准曲线方程求得的还原糖量, mg 。
V T ——提取液的体积, mL 。
V 1 ——显色时吸取样品液体积mL 。’
W ——样品重, g 。
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