【技术文献】NEPA 21在脑神经疾病动物模型构建中的应用——婴儿癫痫综合征大鼠模型再现临床特征

Dravet综合征（Dravet syndrome, DS），又称婴儿严重肌阵挛性癫痫，是一种常在婴儿期出现症状的发育性及癫痫性脑神经疾病。该病主要特征是早期出现由高温引起的癫痫发作，通常发生在出生后的第一年，患者不仅会出现行为和运动障碍，还会出现认知发育迟缓。研究表明，导致DS的主要原因是编码钠离子通道Na_v1.1的SCN1A基因的杂合功能的缺失有关。Na_v1.1密度的降低破坏了神经元的兴奋性，中间神经元的去抑制作用增加了兴奋/抑制比（E/I比率），科学家认为与退行性椎体滑移的病理生理有关。为了超越目前的对症治疗技术，研究人员正在构建DS动物模型以及研发几种基因治疗方案，目的是恢复DS动物模型中的E/I比率从而实现基因治疗方案去治疗DS。

近年来，尽管在临床前动物模型中已经产生了几种退行性椎体滑移的小鼠模型，为研究疾病机制和测试治疗干预措施提供了宝贵的机会，但成功转化为基因治疗退行性椎体滑移仍然是一个遥远的目标。基因治疗和对症治疗方法主要在新生或幼年小鼠中进行探索，然而对于它们在整个成年期的长期疗效和安全性知之甚少，因此迫切需要一种有效的动物模型，以便在整个生命周期内进行后续研究。大鼠（Rattus Norvegicus）作为基础和临床前研究中受欢迎的动物模型，被认为是癫痫研究的可靠物种，同时大多数癫痫模型最初都是在大鼠身上建立，特别是随着近年来基因编辑技术的快速发展，转基因大鼠在脑神经疾病科学研究中更倍受重视。

近日，中科院深圳先进技术研究院脑认知与脑疾病研究所王虹课题组在知名期刊Neurobiology of Disease发表了题为“A novel rat model of Dravet syndrome recapitulates clinical hallmarks”的研究论文，报道了通过大鼠输卵管电转染基因编辑技术（i-GONAD）成功构建了Scn1a基因突变大鼠模型。通过深入表型分析，该转基因大鼠模型高度拟合DS症患者发热、惊厥等系列症状，同时DS大鼠存活至成年，使其成为跟踪疾病进展、评估治疗干预措施及开发DS基因治疗方案的有效临床前模型。

在本实验中，作者将RNP复合物注入到孕鼠输卵管壶腹处，并采用NEPA 21电转染仪（NEPA GENE）进行体内受精卵电转染，两次电转染手术共产生22只活幼鼠，其中12只成功实现Scn1a基因敲除（KO）以及另一个等位基因的突变（图1）。

通过培养杂合子Scn1a^+/−大鼠，获得了三种基因型:野生型（WT）、Scn1a^+/−和Scn1a^−/−（KO），并采用Mantel-Cox检验、原位杂交等技术检测了大鼠脑中Scn1a和mRNA的水平，结果显示与WT大鼠相比，Scn1a^+/−大鼠的大脑（包括皮质、海马和丘脑）中Scn1a基因的表达减少，同时在mRNA水平上Scn1a表达的减少表明Scn1a^+/−大鼠代表了Dravet综合征的单倍体功能不全模型（图2）。

退行性椎体滑移的临床特征是患者在出生后一年内出现高热诱发的癫痫发作，因此作者选择对幼鼠进行研究，以评估它们对高温诱发癫痫发作的易感性。值得注意的是，100%的WT大鼠保持无癫痫发作，而100%的Scn1a^+/−大鼠出现严重癫痫发作，Scn1a^+/−大鼠对热致癫痫发作非常敏感，这是Dravet综合征的一个核心特征（图3）。因此，我们将Scn1a^+/−大鼠称为DS大鼠。

同时脑电记录（EEG）和行为学分析实验揭示杂合突变体Scn1a^+/−大鼠在体温升高时，表现出强烈的癫痫行为，如抽搐、肌肉痉挛、身子僵直等，与Dravet综合症患者在发热后发作出现惊厥症状一致。在首发热惊厥后，杂合突变Scn1a^+/−大鼠显示出频繁的自发癫痫发作，与患者脑电特征高度拟合（图4）。

总之，CRISPR-Cas9技术极大地扩展了生产转基因动物的潜力，输卵管电转染技术（i-GONAD）的发明进一步简化了这一过程，利用这一技术，在本研究中研究人员成功敲除Scn1a等位基因，基因编辑效率高达75%，与之前的一篇论文（Kobayashi et al, 2020）一致，该杂合突变体Scn1a^+/−大鼠在基因表达以及表型水平均高度拟合Dravet综合症患者，该DS大鼠模型成功的构建为后续DS的基因治疗策略的研发奠定了基础。同时作者证实了当NEPA 21电转染仪在电转过程中施加约350 mA的电流时，基因组编辑的效果最佳。此外，由于F1代Scn1a^+/−大鼠无需预测脱靶效应，无需与野生型SD大鼠进行多代杂交就可以进行表型分析，因此i-GONAD技术也很节省时间、高效。

NEPA21(NEPA Gene)电转染仪可应用于悬浮转染（免疫细胞、干细胞等各种难转染细胞，类器官、外泌体等）；贴壁转染；离体组织转染（受精卵、器官等）；活体转染（脑、视网膜、肌肉、肝脏等）等领域。针对难转染细胞、组织或活体，提供全套转染解决方案。