细胞化学技术

    细胞化学技术(cell cytochemistry)是在保持细胞原有形态、结构基础上，利用已知的化学反应，原位显示细胞内某些化学成分，通过显微镜进行定位、定性、定量分析的方法。借助这一技术可以直接观察到细胞的形态特征、化学成分、化学性质，联系在不同条件和状态下的细胞形态、化学和功能的综合变化，对疾病和细胞损伤进行诊断、鉴别、分类及预后。与有机染料相比，细胞化学技术更具有特异性，效果稳定，费用较低，即使在免疫细胞化学流行的今天，也仍不失为有效的研究技术。

    对于细胞化学技术的基本要求：①保持细胞原有结构；②保持细胞内的原有化学成分和酶活性；③采用的方法可靠、可信，具有高度特异性；④反应形成的物质能在电镜和光镜下被观察到。

一、酸性磷酸酶

(一)原理

    酸性磷酸酶(acid phosphatase)是溶酶体的特征性酶，故常用此法对溶酶体进行研究。酸性磷酸酶在酸性条件下分解0甘油磷酸钠，释放出的磷酸根与醋酸铅的醋酸根置换，形成磷酸铅，后者与硫化胺作用，最终形成棕黑色的硫化铅沉淀物，镜下清晰可辨。Mg 2+可促进该酶的活性。

(二)材料

1．待测细胞标本组织切片或在盖玻片上生长的培养细胞(爬片)或细胞涂片。

2．巴比妥醋酸缓冲液(pH4．8) 可先配制储备液，用前再配成工作液(工作液容易长菌，4℃环境亦不能长久保存)。

(1)储备液：醋酸钠·3H2O  0.97g、巴比妥钠1.47g，加蒸馏水至50ml。

(2)工作液：巴比妥一醋酸缓冲液储备液5ml，加8．5％NaCl2ml、0.1mol／L HCl10ml、蒸馏水8ml。

3．巴比妥一醋酸铅T作液(按序加入下列溶液) 巴比妥一醋酸工作液12mL，3.3％醋酸铅水溶液0．38ml，蒸馏水32ml，3.2％8甘油磷酸钠4ml，0.6％硫酸镁1ml。用0.1mol／LHCl调pH至5.O，此液宜现用现配，加入甘油磷酸钠时应边震荡边缓慢滴入，避免出现沉淀。若有沉淀，则须过滤，但过滤后效果不稳定。

(三)方法

1．用10％甲醛(新鲜配制)固定标本5min。

2．用蒸馏水洗2次，各2min。

3．置于巴比妥一醋酸铅工作液中，37℃孵育30min～4h。孵育时间长短与细胞溶酶体的估计含量成反比。

4．用蒸馏水洗3次，各1min。

5．用l％醋酸溶液约30s，洗去非特异性吸附的铅沉淀。

6．用蒸馏水洗3次，各1min。

7．1％硫化胺水溶液(现用现配)作用1～2min。

8．用自来水冲洗5min。

9．可用苏木精复染细胞核。

lO．分别以梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明，树胶封片(方法同HE染色)。

11．设立对照组有两种方法：①在工作液中免去底物β甘油磷酸钠。②在工作液中加入酶抑制剂0.01mol／L氟化钠。

(四)结果

    酸性磷酸酶活性存在部位有棕黑色沉淀物，对照标本无此沉淀