组织培养细胞的注意事项

    随着医学的发展，细胞培养技术在药理学研究中得到广泛应用，特别是药物对机体的药效作用，有否毒性作用，必须通过体内和体外实验进行验证。体内实验可采用动物实验，体外实验则可通过药物对培养细胞的作用来判定。同时体外细胞培养技术也为深入探讨药物作用机制和有效药物的筛选提供实验平台。本章主要介绍的实验有：药物对细胞增殖影响的实验、血糖药物研究实验、抗肿瘤药物敏感性检测实验和血管平滑肌增殖抑制实验。

    近年来随着培养技术的发展，组织培养细胞已成为测试药物效应的常用对象。用培养细胞做药物检测时，也需要注意一些事项。

一、细胞选择

    利用组织细胞做药物检测时，首先要考虑选择什么细胞作为实验对象，细胞选择不当，会影响实验结果的可信性和参考价值。在药物效应不明的情况下，对细胞的选择可不必十分严格。如已知药物有特殊效应或欲求得对某一类细胞产生特定作用时，应尽量选用相应的细胞。进行药物测试实验时，对照细胞是实验组合中不可少的组成部分，细胞种类的应用原则也是符合性越大越好。

二、检测药物

    最适宜的药物剂量应是：对正常细胞无影响或伤害最小(能恢复)，而杀伤效应或特异性最大的药物剂量。用培养细胞作药物测试，用经验测试法是比较实用的。即应用在一定药量范围内递增药量的测试办法；确定一组药量梯度数值，安排一组培养细胞，用多孔板培养细胞进行检测，分别向各组培养细胞中加入不同的药量。作用一段时间后，用台盼蓝染色法测试死活细胞比数，取50％死亡细胞组作为粗ID(近似值)。为求得确切的ID，尚需做进一步的测试直至找到合适剂量为止，比较快和合理的办法是观察药物对细胞形态和增殖生长的影响。

三、测试程序中的注意事项

(一)细胞

1.实验细胞如药效特点不明，可用HeLa、KB等通用癌细胞系。细胞引入后，选生长状态良好的原瓶细胞。消化分离后接种人大瓶备用，待大瓶细胞增长至足够数量后，取l～2瓶细胞用胰蛋白酶消化制成细胞悬液，分成等量接种入若干多孔板或15ml培养瓶中。用培养瓶测试时，一般每一剂量组至少接种21瓶；分7组，每组3瓶细胞。

2．对照细胞根据被测药物性质和要求应选用与之相应的二倍体细胞做对照；一切培养条件均应与实验组相一致。仅用一种癌细胞，分成加药组和不加药组．而不用相应正常细胞作为对照组是不正确的。

(二)加药

1．加药时间给药时间可采用接种前给药和生长中给药两种方法。生长中给药是常用的测试药物方法。进行生长中加药时，取ID 50／10为实验剂量，加药时间宜在接种细胞后约第48小时。

2．药物作用持续时间 药物在瓶皿中与细胞接触时间不应少于8h，一般可处理12～24h或更长。体内用药时，每批实验过程中(一般为7d)，让药物始终作用细胞。对照组做同样处理，加等量的BSS或助溶剂。

(三)观察

1．形态结构细胞受药物作用后，形态上很易发生改变，如成纤维细胞突起回缩、上皮细胞相互分离等．这些变化在一般光学显微镜下很易观察到。但这些变化不一定十分可靠，形态变化应主要以超微结构的改变为依据，观察药物对细胞膜、微绒毛、内质网、线粒体和染色质等微细结构有无影响。

2．生长和增殖培养中的细胞有时可能仅有生长而无增殖，特别是进行分化的细胞更是如此。因此不能单靠细胞数量作为判定细胞增殖唯一的标准。其他一些现象如肌细胞的增粗、神经细胞突起的增长等均为细胞生长的表现。

3．细胞死亡凡能引起细胞内相互制约系统中一个或多个环节的紊乱，最终导致细胞机能障碍、进而缓解死亡的现象，都应视为细胞死亡的范畴。如氰化物抑制细胞氧化磷酸化阻断ATP供应、氯霉素干扰蛋白质合成并抑制细胞修复等，这些作用都有一个发展过程，最终能导致细胞死亡。因此确定细胞的死亡必须有一个时间范围。