蛋白酶筛选方法的原理

我们实验室开发的蛋白酶筛选方法的原理：

展示了蛋白质的噬菌体通过N端的组氨酸标签与镍基质结合（步骤1）；用蛋白酶处理结合后的噬菌体，展示了对蛋白酶作用敏感的蛋白质的噬菌体被从基质上切除，并被洗涤下来（步骤2）；然后从镍基质上将展示了蛋白质的、能抵抗蛋白酶作用并因此保持与基质结合的噬菌体洗脱下来（步骤3）；将这些噬菌体扩增，以供进一步的筛选或DNA序列测定（步骤4） 用噬菌体展示进行蛋白酶筛选的两种方法的对比： （a）我们实验室开发的基于亲和性的方法；（b）Plackthun/Schmid小组和Winter小组描述的将蛋白质的酶解和噬菌体的感染力相结合的方法

从某种角度来看，这一步骤在原理上与底物噬菌体展示相似，该文库（这种情况下为线性肽）也被展示在亲和性标签和pⅢ之间，从而能固定于固体基质上。然而，在这种情况下用特异性蛋白酶进行处理是为了鉴定底物特异性，被切割的肽随后被鉴定为酶的底物。相反，我们设计的方法是用来筛选由于折叠而具有抵抗蛋白酶作用的蛋白质，尽管它们含有蛋白酶酶切位点。

如前所述，还有另外两个小组也成功开发出使用噬菌体展示技术和蛋白酶解筛选出稳定的蛋白质的方法。在这些方法中，亲和性标签不是必需的，但是被展示蛋白的酶解和噬菌体的感染力（infectivity）是直接相关的。目标蛋白插入到pⅢ蛋白具有感染力的N端结构域（N1、N2）与锚定在噬菌体上的C端结构域之间。因为N端结构域是噬菌体感染进入大肠杆菌所必需的，如果由于插入的接头被蛋白酶水解而使得这些结构域被切除，则会导致噬菌体失去感染力。因此，经过蛋白酶筛选之后，只有那些展示了能抵抗蛋白酶作用的稳定蛋白质的噬菌体才能增殖。

Pltiekthun/Schmid小组和Winter小组的方法有一个潜在的缺点：它们与常规的单价展示无法谐调。这是因为在展示噬菌体上存在着野生型pⅢ蛋白，这会使得它们被筛选及增兰?而不管pⅢ—融合蛋白是否已经被切除，从而造成假阳性。Sieber等人通过另一个噬菌体系统来解决该问题，在该系统中，所有拷贝的pⅢ蛋白都与目标蛋白相融合（如多价展示系统）。相反，在筛选中要使噬菌体丧失感染力则要求所有拷贝的被展示蛋白都被酶切。Kristensen和Winter通过构建能提供蛋白酶敏感性的pⅢ蛋白的辅助噬菌体巧妙地克服了这个难题。