细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤

贴壁细胞免疫荧光法

(1）  在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min。

(2）  4%多聚甲醛固定细胞爬片15min。

(3）  1XPBS洗涤3 次，每次5min。

(4）  0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。

(5)    1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(6）  1%BSA室温封闭30min。

(7）  弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。

(8)    1 ×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(9）  细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。

(10)  1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

(12）1×PBS洗涤3 次，每次5min。

(13）用抗荧光淬灭剂封片。

(14）荧光显微镜下观察采集图像。

悬浮细胞免疫荧光法（一)

(1）  收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。

(2）  离心吸去 PBS，4%多聚甲醛固定液，重悬细胞，置冰上固定30 min。

(3）  离心、吸去固定液，用4℃ 1×PBS重悬细胞，离心800 g 离心5 min，去PBS，留细胞沉淀。

(4）  0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。

(5）  离心800 g离心5 min，去通透液，留细胞沉淀。

▲注意:步骤（4）和(5）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤

(6）  使用1% BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

(7）  离心800 g离心5 min，去封闭液，留细胞沉淀。

(8)    孵育一抗,浓度根据抗体说明书操作,4℃摇床孵育过夜(一般孵育15-16h)。

(9）  用4℃ 1×PBS稀释细胞和抗体，离心，吸去PBS，以4℃ 1×PBS重悬细胞，重复1次。

(10)  吸去PBS，二抗孵育液（二抗浓度根据抗体说明书操作）重悬细胞，4℃温育30-60min，重复步骤（9)。

(11）避光条件下，DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

(12）重复步骤（9)。

(13）用少量的PBS重悬细胞，然后用吸管铺到载玻片上，用盖玻片覆盖。( 14）使用荧光显微镜进行观察拍照。

悬浮细胞免疫荧光法（二)

(1）  悬浮生长细胞:取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。把细胞片浸入95%乙醇或丙酮中固定。

(2)    1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(3)    0.5%Triton X-100(PBS配制）室温通透10min。

(4）  1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

▲注意:步骤（3）和(4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤。

(5）  使用1% BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

(6）  按抗体推荐使用说明书孵育一抗，4°C湿盒中静置过夜。

(7）  次日取出细胞片，室温下复温30min。

(8）  1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(9）  选取相应的免疫荧光二抗滴加于细胞片上，37°C避光孵育30-60min。

(10）1×PBS洗涤3 次，每次5min。

(11）避光条件下，DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

(12）1×PBS洗涤3 次，每次5min。

(13）在细胞片上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。

(14）使用荧光显微镜进行观察拍照。