做免疫组化不知道这10个经验？

1要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片;但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。

2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能会使抗原弥散;切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡,如写着两者都可，那就都能做。

3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片,为了防止RNA降解,保存一贯很重要。于石蜡切片可以切到4μm左右,所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

1.单克隆和多克隆抗体的选择。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，-般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等避免)。

2.应用范围的选择。有的一抗只能用于WB (Westernblotting) 或免疫组化、兔疫荧光、免疫沉淀等;甚至表明石蜡切片或冰冻切片。

3.种属反应性的选择。这一点很重要， 表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

4.种属来源， -般兔来源的多是多克隆;而小鼠来源的多是单克隆，但也有另外。根据此来源来选择相应的二抗。

1.TritonX- 100化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚,是-种去污剂。在免疫组织化学(10μm以上厚切片)和免疫细胞化学中一般用TritonX-100作为细胞通透剂， 在膜上打孔。

2.其作用原理: TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

3.TritonX-100既是一种表面活性剂， 也有抗氧化作用。

1.膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。

2.封闭血清一般是和二 抗同一来源的，血清中动物自身的抗体,预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合,会造成背景。

3.也可以用小牛血清、BSA、 羊血清等，但不能与-抗来源-致。

1.一 抗孵育温度有几种: 4°C、 室温、37°C, 其中4°C效较好;孵育时间:这与温度、抗

体浓度有关，-般37°C, 1-2h, 而4°C过夜和从冰箱拿出后37°C复温45min。

2.二抗一般室温或37°C, 30min-1h, 具体时间需要摸索。

1.一方面，防止切片从4°C直接放入PBS易脱片。

2.另一方面，使抗原抗体结合更稳定。-般不需要，但对表达较弱的抗原可能有用, 4°C和

37°C时分子运动方式不同，前者分子碰撞机率和运动速度小于后者后者结合更快，但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

3.其实,我更赞同后-种说法，因为我尝试把肝脏或睾丸片子从4°C过夜拿出后，直接用PBS洗没发生过脱片现象。事实胜于雄辩。

1.DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。

2.DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

3.若很短时间就出现背景很深，还有可能是你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。

4.DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色，-方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(一 抗4oC过夜) ;另一方面就是封闭时间过长。

1.阳性着色细胞计数法。在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3-6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。

2.灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用imageJ进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。

3.评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、 26- 50%、51-75%、 76-百分之百) ，最终可以分数相加，再进行比较。

对于以上这几种方法，各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。