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干货|如何玩转WB实验
免疫印迹（Western blot，WB）是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一，WB先要进行SDS-PAGE，然后将分离的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后，利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量，
免疫印迹（WB）实验流程
【免疫印迹（WB）实验流程图】
1. 玻璃板清洗后，为了使表面的水快速晾干，可以在烘箱中放置几分钟，拿出来的时候后需平衡至室温再灌胶，不然很容易产生气泡；
2. 配胶用的试剂一般都是在4度冰箱保存，当我们按比例配好混合液的时候，要等混合液恢复室温时，再灌胶，不然也很容易产生气泡；
3. 玻加水液封时，速度要慢，可用1ml枪沿着胶板上沿反复移动，不然很容易将分离胶冲变形；
4. 梳子注意和玻璃板匹配，1.5mm的梳子很难插进1mm的玻璃板中，暴力插入会破坏胶板；如果1mm的梳子插到了1.5mm的玻璃板中，由于中间有空隙，就会有胶凝固在里面；
5. 浓缩胶凝好可以泡到电泳缓冲液里，比较容易拔出。
4.两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和PVDF膜（正电荷尼龙膜），根据不同需要选择（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5分钟，否则转膜时会导致条带变形。
1．对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%或更低，但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心，
2.大蛋白易在凝胶里形成聚集沉淀，因此；转膜时在电转移缓冲液加入终浓度为0.1%的SDS，以避免出现这种情况，甲醇易便SDS从蛋白上脱失，因此应降低电转移缓冲液中甲醇的浓度至10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3.降低电转移缓冲液中甲醇的比例以促进凝胶的膨胀，易于大蛋白的转出。
4．如果使用PVDF，甲醇是必需的，且转膜前PVDF需用甲醇活化。但如果是NC膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中。
5．选择湿式，4 ℃转膜过夜，以取代半干式转膜。
1. SDS妨碍蛋白与膜的结合，特别是对小蛋白更是如此，因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加SDS。
1. 脱脂奶是最常用的经济配方。
2. 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用，因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素；建议使用BSA。
3. 分析磷酸化蛋白须用BSA。脱脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响，因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。
4. 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统，封闭液不应加叠氮钠(NaN3)，因为叠氮钠对辣根过氧化物酶（HRP）有灭活作用。
5. 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统，可使用酪蛋白封闭，同时须选择TBS缓冲溶液，不可使用PBS缓冲溶液，因为PBS缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。
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