RT-PCR入门：基础知识

RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种研究领域。今天小编就带大家来详细了解一下这项技术，感兴趣的老师不要错过哦！

虽然原理上PCR需要以DNA作为模板，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA后，PCR法便可应用于RNA的解析了，这就是今天我们要介绍的RT-PCR技术。

RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种研究领域。今天小编就带大家来详细了解一下这项技术，感兴趣的老师不要错过哦！

一、RT-PCR原理

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和以cDNA为模板的聚合酶链式反应（PCR）相结合的技术。整个反应过程分为两步，一步是经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA的过程；第二步是以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增目的片段的过程。

我们以PrimeScript RT-PCR Kit（Code No.RR014）为例，来看一下RT-PCR反应的原理图：

二、一步法 or 两步法RT-PCR

RT-PCR原理中介绍了整个反应过程分为两步，根据这两步反应是否在单管中操作，可以将其细分为一步法（One-step）RT-PCR和两步法（Two-step）RT-PCR两种，两者的区别与特点汇总如下：

三、反应组分的选择

反转录（RT）反应

①模板

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

②引物

反转录引物的选择，应结合实验的具体情况，选择以下三种引物，即：Random 6 mers、Oligo dT Primer或特异性下游引物。对没有发夹结构的短链mRNA，上述三种引物都可以使用；一般情况下的反转录引物的选择请参照以下说明。

对于基因特异性引物（GSP），推荐Takara公司提供的DNA/RNA合成服务，我们的优势如下：

③反转录酶

目前市面上常见的反转录酶主要有AMV和M-MLV两种，后者的使用率更高一些。此外，Takara公司在M-MLV来源的反转录酶基础上，特别研发了PrimeScript RTase系列，大大降低了反转录酶本身对于RNA的非特异结合，同时提高了反转录引物的特异性。通过这两个特点与本酶具有的强置换延伸活性，在对RNA损伤很小的42℃条件下，对于结构复杂的RNA及长链RNA也能够合成低背景的cDNA。

聚合酶链式反应（PCR）

PCR反应部分，则以酶的选择最为重要。根据扩增性能及下游应用对保真性要求的不同，主要分为普通PCR酶和高保真酶两种类型。

四、RT-PCR需注意的细节

1. 实验过程中必须戴口罩、手套，尽量避免其他人员干扰。

2. RT试剂盒从冰箱拿出，应该充分解冻，瞬离后，混匀，放于冰上，可在冰上加样。试剂可以用数字贴纸编号，避免漏加、错加试剂。

3. 取用不同的试剂时，必须更换枪头，样本之间要避免交叉污染。

4. 逆转录时，PCR仪可以先预热。

5. 反应体系配好之后，应充分混匀，瞬离，并且弹去管内的气泡。

6. 实验过程中应预防RNA酶污染，使用无酶枪头以及EP管，同时台面可以使用固相RNA酶去除剂清洁。

7. PCR时，管壁尽量避免写字。

8. 管盖一定要盖严。

9. 10μL逆转录反应体系建议加入不超过500ng的RNA。

10. 如果目的基因表达量非常低,最多加入1μg Total RNA,否则加入RNA量过高,可能会超出后续PCR的线性范围。

11. 反应体积可根据需要等比例放大。

12. 试剂尽量不要反复冻融。

13. 每个样品至少3个平行孔,所有成分加完后，离心去除气泡。

14. 可将所有共同物质加入同一管中，混匀后分散入其他管中。

消息来源：生物帮
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