ELISA试剂盒双抗夹心法/一步法检测步骤心得

上海钰博

2017/08/30 18:29

阅读：89

ELISA试剂盒双抗夹心法/一步法检测步骤心得

ELISA试剂盒双抗夹心法试剂盒测抗原的注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作ELISA双抗夹心法试剂盒检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。ELISA双抗夹心法试剂盒ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。

ELISA试剂盒抗原最常用的方法，操作步骤如下：

1、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。

3、洗涤除去其他未结合的物质。

4、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。

5、此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

6、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

7、根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

ELISA试剂盒双抗夹心法试剂盒一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

ELISA试剂盒在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同。