人真皮成纤维细胞--新生

人真皮成纤维细胞--新生具体操作：

1.首先不加胰酶，倒掉旧培养基加入少量新培养基洗1-2遍，（这是前奏，即为第一步，目的是将漂浮着的死细胞之类尽量洗掉。

2.然后再加入少量新培养基直接吹打一遍，这一遍是把贴壁不牢固的细胞吹打下来。再用培养基洗一遍，两次所得悬液混合传入新瓶。即为第二步（可以将这些传入新瓶培养，以与后面胰酶消化过的细胞对比观察看谁长的更好一点就知道该细胞对胰酶的敏感度了）。

3.吸干净瓶内剩余液体，加入0.3ml左右的胰酶润洗一遍，吸掉弃之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下观察，待细胞与细胞之间间隙明显的时候立即吸掉胰酶与干净子弹头里备用，加入新培养基开始吹打，吹打2-3遍后吸取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培养基洗一遍与前面的混合。（也可以传入新瓶培养，以与后面及前面的做对比）这是第三步。

4.然后把前面刚吸出来的胰酶重新加进去瓶里继续消化剩余的贴壁牢固的细胞。当然你也可以用新的胰酶，如果你们那比较富裕的话，呵呵。继续镜下观察，待剩余细胞间隙明显，细胞独立开来的时候，吸掉胰酶，加入新培养基吹打。悬液传入新瓶培养（根据实际情况你自己把握）。

人真皮成纤维细胞--新生应用举例：

1.细胞表面分子的检测与分析；

2.细胞内或细胞核内抗原检测与分析——如胞内细胞因子、调节性T细胞（Treg，CD4+CD25+Foxp3+）；

3.细胞凋亡的检测与分析——如PI单染法、Annexin-V-PI复染法、末端转移酶标记技术（TUNEL）、细胞周期特异性细胞凋亡的检测（PI-Annexin-V，PA法）；

4.DNA含量检测与细胞周期的分析——如药物对细胞周期的影响、流式细胞核型分析；

5.细胞增殖的检测与分析。

人真皮成纤维细胞--新生服务流程：

1．根据细胞特点、实验特点或实验需求，设计实验方案并与客户讨论确定实验方案；

2．进行预实验，通过转染含有GFP报告基因的质粒确定最佳转染试剂，并优化转染条件；

3．杀伤曲线绘制；

4．转染质粒，铺板，用不同抗生素浓度筛选细胞单克隆；

5．qPCR和WB检测稳定克隆的外源基因表达水平。

人真皮成纤维细胞--新生注意事项： 

1. 原代培养，一定要避免污染。

2. MEF生存能力有限，如果不冻存，体外存活十代左右。

3. 冻存后复苏的细胞只能传代一次，因为这些细胞繁殖能力有限。

4. 消化细胞时间不要过长。

一般实验流程 

1筛选浓度测定：以10～14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度 

2细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%～80%覆盖 

3细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6） 

4利用质粒上含有的抗性选择进行筛选 

5鉴定筛选结果 

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