基因高效快速表达试剂盒

品牌：ZIQIBIO

CAS号：NULL

供应商：上海子起生物科技有限公司

数量：大于10个

保质期：2-3年

保存条件：4度或以下

基因高效快速表达试剂盒使用说明书

名称             KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒     

货号           KIT-03112   技术热线400-811-9081

包装规格       一家实验室购买一套可永久无限次使用

试剂盒内容    （1）9种表达载体

              （2）2种穿刺菌种

              （3）1种抗生

如有需要产品说明书请拨打技术热线400-811-9081

一、产品简介

二、基因克隆

三、基因表达

四、载体资料

五、相关产品

六、参考文献

七、试剂盒质量验收标准

  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

一、产品简介

原核表达系统近年来研究取得突破性进展

1998年，美国Incyte Pharmaceutical公司华裔科学家Zhang Yang在《Protein expression andpurification》(vol12,159-165)上发表论文《Expression of Eukaryotic proteins insoluble form in Escherichia coli》，文章采用E.coli分子内伴侣DsbA技术将IGF-I、IGFBP-3、3Cproteinase、TGFb-2、STGFb-RII、BDNF、GDNF、mEGFBP、Leptin和GFP十个基因全部实现了可溶性表达，且表达量均大于25%。更为惊奇的是由于DsbA分子伴侣的作用使得拥有9个半胱氨酸的复杂结构的IGFBP-3能在E.coli内形成可溶性具生物活性的高表达重组蛋白。

2002年，美国冷泉港实验室出版的《ProteinScience》(2002,11:313-321)上发表了瑞典科学家Torleif《Rapid screening for improvedsolubility of small human proteins produced as fusion proteins in Escherichia coli》一文，从而揭开了原核高效快速组合筛选表达系统用于蛋白组学研究的序幕。

近年来Medline报导了大量利用原核表达获得有活性的可溶蛋白，现举例如下：GeneExpression methodIndexProinsulinDsbA fusionJ.Biotechnol 2001 84(2):175-85htPADsbA coexpressionAppl Environ Microbiol 1998 64(12):4891-6Bovine enterokinaseDsbA fusionBiotech nology(NY),1995,13(9):982-7MucinMBP fusionProtein Expr Purif 1999,15(1)146-54Human angiogeninOmpA signalBiochem Mol Biol Int1999,47(2):267-73Bacillus lipaseOmpA signalAppl Microbiol Biotechnol 1998 Apr;49(14):405-10HEV antigenThioredoxin fusionZhonghua shi yan he lin chuang bing du xue za zhi 2002,16(1):20-2P55 TNF receptorThioredoxin fusionProtein Expr purif 2001,23(2)226-32hLH/CG receptorThioredoxin fusionEndocrine 2001,14(2):205-12Pokeweed antiviral proteinMBP fusionProtein Expr Purif 1999,15(1)146-54 

  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

产品特色

本公司通过和留美学者合作，现向国内推出原核基因高效快速表达试剂盒。它将九种表达载体包括分泌型、引导分泌型、胞内直接表达型、分子内伴侣协助折叠型、高度稳定伴侣型等系统的多克隆位点统一，同时统一了诱导表达剂和统一了培养基，一次可以同时克隆九种载体进行表达筛选，极大地节省宝贵的科研时间。其实，象美国Amgen、Gentech、Incyte这类顶尖的生物技术公司也是采用多系统多载体同时筛选快速表达的策略。这一策略的最大优势就是快速且成功率高。本系统非常适合高通量快速筛选大量未知基因，对基因组学和蛋白组学的研究是一个不可缺少的工具。

1）提供详实的操作说明和丰富的参考文献。

2）下游多种亲和层析组合方便您快速纯化目的蛋白。

3）分子内伴侣和分泌表达能最大限度避免包涵体形成，直接获得有活性可溶蛋白，这一点对于未知基因功能的研究很重要。

  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

4）九套高效表达载体同时克隆筛选，极大地节省您宝贵的科研时间。

5）T7溶菌酶和lacIq阻遏蛋白能起到严格控制诱导前表达的作用，同时强启动子、高拷贝复制子等方法结合可获得高达50%的表达量。

6）已有400多个基因通过该试剂盒而表达成功。

本试剂盒包括：穿刺菌株、抗生素和统一多克隆位点的九种表达载体。用户只要扩增出一段不带终止密码子或带终止密码子的阅读框编码基因克隆进九种表达载体，可同时筛选，节省时间。一般两至三周可以筛选出表达菌株，在此基础上，进一步根据需要进行实验室菌株的优化从而成为工程菌株。

 本试剂盒采用的技术路线如下：

您提供的基因ORF    九种表达载体

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克隆

        ˉ诱导（小样）

          ˉSDS—PAGE分析

筛选出表达菌株

ˉ

发酵（中样）

ˉ

亲和层纯化融合蛋白

ˉ

纯化

ˉ  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

目标蛋白

由于大肠杆菌表达系统遗传背景清楚、易于大规模发酵等优点，尤其是近年来采用分子内伴侣的技术（如Trx、DsbA等）使得许多外源基因能在E.coli里正确折叠，如IL—11、GM—CSF、INF、 Insulin甚至包括结构复杂的tPA等均可获得正确折叠的重组可溶性活性蛋白，使得E.coli高效快速表达系统仍然是分子生物学实验室一个不可缺少的工具。

本试剂盒包括冻干菌株、抗生素和统一多克隆位点的九种表达载体。用户只要扩增克隆出一段不带终止密码子或者带终止密码子的阅读框编码基因克隆进九种表达载体，可同时筛选，节省时间。一般两至三周可以筛选出表达菌株，在此基础上，进一步根据需要进行实验室菌株的优化从而成为工程菌株。

pLLP—OmpA表达载体采用E.coli强启动lpp和OmpA分泌信号肽，同时在C端添加了6个His可采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达载体成功地实现过人生长激素的基因工程工业化。经多年临床验证，分泌型重组人生长激素临床副反应大大低于包涵体型的重组人生长激素。

pLLP—STII表达载体采用E.coli强启动lpp和STII分泌信号肽，同时在C端添加了6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。STII信号肽引导能力强且易于被E.coli信号肽酶切割。即使第一个氨基酸是半胱胺酸的干扰素也可以实现分泌表达。

pMBP—P表达载体采用 E.coli tac启动子和分泌型麦芽糖结合蛋白（maltose bindingprotein）同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量的背景文献参考。它通过MBP引导分泌，可以实现许多基因在周质空间里正确折叠，如TPO（1-153aa）、GM—CSF、IL—2等。我们采用这一表达系统配合固相化的凝血酶成功地获得了正确折叠的rhGM—CSF，临床试用表明其副反应比包涵体型rhGM—CSF大大降低。该表达载体表达的蛋白还可通过Amylose亲和层析。

pMBP—C表达载体采用E.coli tac启动子和胞内可溶性麦芽糖结合蛋白（maltose bindingprotein），同时选用凝血酶切割位点并在C端添加6个His便于采用chelating sepharose亲和层析纯化目标蛋白。该表达系统在Medline里有大量背景文献参考。它通过MBP胞  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

内融合表达，表达产物可占菌体的20%—30%，可形成可溶性蛋白，也可形成包涵体。融合蛋白还可以通过Amylose亲和层析纯化。

pET—GST表达载体采用T7启动子和GST融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。本公司有高纯度的重组人鼻病毒14亚型3C蛋白酶出售，同时还有专一性吸附该蛋白酶的树脂出售。此外，C端还添加了6个His，便于采用chelatingsepharose亲和层析。本载体表达的融合蛋白可采用吸附GST的亲和层析和6个His的chelating sepharose双重亲和层析，极大地方便了下游纯化。GST融合表达背景文献在medline里极为丰富，有数百个基因采用GST融合表达成功。

pET—Trx表达载体采用蛋白质工程改造的硫氧还蛋白即将其中两个氨基酸突变成His，使硫氧还蛋白在空间立体结构上形成三个组氨酸位点（His-patch），便于采用chelating sepharose亲和层析。该表达载体采用T7启动子和（His-patch）Thioredoxin融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。硫氧还蛋白作为分子内伴侣可以帮助许多基因在E.coli胞内正确折叠如IL—3、IL—6、IL—11等。

pET—His表达载体采用N端6个His和T7启动子。高效表达产物的N端具备6个His，便于采用  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

chelating sepharose 亲和层析纯化目标蛋白。同时该载体选用了凝血酶专一性切割切点。融合蛋白既可以采用高纯度限制级的冻干凝血酶液体切割，也可以采用固相化凝血酶切割。

pTrc—CKS表达载体采用E.coliTrc启动子和蛋白质工程改造过CKS (CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonatecytidylyltransferase or CMP-KDOsynthetase)基因融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。CKS融合表达是美国Abbot公司的专利，CKS融合蛋白研制成功HIV和HCV重组抗原并取得FDA认证在美国上市。CKS是一个非常稳定且高度可溶的理想融合伴侣。本发明除去掉CKS C端8个氨基酸外，还将C端Met突变成Thr，一方面可报自已的专利，另一方面有利于基因表达。

pET—DsbA表达载体采用T7启动子和DsbA基因融合表达，同时选用凝血酶切割位点。DsbA是近年来发现帮助二硫键形成的重要分子内伴侣之一。本试剂盒DsbA基因去掉了信号肽，同时将DsbA氧化还原功能相关的两个半胱氨酸（cys）突变成丝氨酸（ser），这样与突变后的DsbA融合可实现许多基因的胞内可溶性有活性的高表达（表达量大于30%），如IGF—1、IGFBP、EGF、Insulin等。

本试剂盒还将两种E.coli穿刺菌株。

 二、基因克隆

1、本试剂盒选用两种大肠杆菌菌株

  KIT-03112     基因高效快速表达试剂盒    

E.coli JM109

E.coli BL21(DE3)plysS

F-ompT hsdSB (rB-mB-)gal dcm(DE3)pLysS(CamR)

2、两种大肠杆菌菌株使用情况

这一点非常重要，务必分清。

（1）九种载体的扩增须采用E.coli JM109，而不能采用E.coli BL21(DE3)plysS。

（2）九种载体的目的基因克隆须采用E.coli JM109，而不能采用E.coli BL21(DE3)plysS。

（3）克隆了目的基因的表达载体，其中1、2、3、4和8号载体即pLLP—OmpA、pLLP—STII、pMBP—P、pMBP—C和pTrc—CKS应转化进E.coli JM109进行诱导表达。5、6、7和9号载体即pET—GST、pET—Trx、pET—His和pET—DsbA应转化进E.coli BL21(DE3)plysS进行表达。

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