T细胞分离用——尼龙毛

T细胞分离用——尼龙毛

在研究体内及体外的免疫系统时，分离淋巴细胞群是一个关键步骤。因为现在市场上并没有针对B细胞的特异性抗血清，所以分离淋巴细胞中的T细胞并不是十分方便。T细胞尼龙毛分离法利用了尼龙毛对B细胞的亲和力，从而使T细胞在没有严重损伤的情况下达到的足够的纯度。因为这个方法不像流式和磁珠费用昂贵，而且操作简便，所需要的条件也不高，是一种非常实用的方法。
首先要指出的是实验中所使用的是分离T细胞专用的尼龙毛(NylonFiber)，不是化工上的尼龙纤维，曾经有人问过我这种问题，如果你买错了，可是做不出来的！
现在市面上有尼龙毛填料，也已经有了商品化的尼龙毛柱子，这两者的区别主要是以下两点：1.商品化的柱子的填料量是已经定好的，有一个确定的上样量范围。而自己买填料装柱可以控制填料量，也就是可以控制上样量，这对于样本量非常少，或是样本量非常大的实验需求非常合适。2.商品化的柱子已经经过了无菌处理(一般是辐射灭菌)，而自己装柱当然就要自己灭菌了。
操作方法：
1.秤取1.5g尼龙毛装入20-30ml玻璃容器或注射器内(要可以灭菌的)，填料的体积控制在15毫升左右(注射器上有标记，所以还是比较好控制的)，因为尼龙毛的松紧关系到T细胞的回收率，所以要特别注意。注射器下端配接5厘米左右长的带有弹簧夹的橡皮管。
2. 加入大量的PBS平衡柱子后，用铝箔包裹，并置于适当的容器内，高压灭菌15分钟。
（商品化尼龙毛柱以上步骤可以省略，经过PBS平衡后可以直接进行下列步骤。）
3. 灭菌的尼龙毛柱垂直固定后放于超净台内，顶部以铝箔覆盖，避免污染。
4. 注射器下端，橡皮管，弹簧夹用无水酒精消毒。打开弹簧夹调节流速在大约3-4ml/min。
5.首先，加入3-4倍柱体的无血培养基平衡，之后加入相同体积的含有血清的培养基平衡（上述培养基都要预热），最后等培养基液面接近柱填料液面时，关闭弹簧夹。
6. 样本细胞悬浮液浓度控制在约5×108cells/ml，上样量一般是1/3-1/5柱体积。样品加入之后，再加入少量培养液，然后关闭弹簧夹。
7.覆盖铝箔，垂直固定，置于消毒过的容器中，于培养箱内37℃孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。
8. 从培养箱中拿出柱子，置于超净台内，除去铝箔。接上按照4.中的方法消毒的弹簧夹和橡皮管，加入适当体积经37℃预热的培养基，打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min，流出约5ml之后，流出的培养液基变得不透明，此时其中含有T细胞，收集这一部分培养基。
9. 基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量，回收率几乎不会增加。
10 。上述操作后，细胞的
回收率为： 15~20 ％

T细胞含量： 85~95 ％
B细胞污染率： 1 5 ％
多数细胞被确定为T细胞。
（注）收集粘附于尼龙毛上的细胞时，将T细胞收集完毕后的尼龙毛再无菌操作的状态下取出，转移到适当的容器中，用镊子小心的将尼龙毛松开，粘附的细胞可以洗到培养基中。或者将注射器芯插入注射器内，通过压力使的粘附的细胞随着液体流出。

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