ELISA基本原理:
抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性;
2. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性;
3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果。
ELISA的分类:
一.直接法测定抗原
将抗原吸附在载体表面→加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物→加底物→底物的降解量=抗原量。
二.间接法测定抗体
将抗原吸附于固相载体表面→加抗体, 形成抗原-抗体复合物→加酶标抗体; 加底物→测定底物的降解量=抗体量。
三.双抗体夹心法测定抗原
将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面→加抗原,形成抗原-抗体复合物→加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物→加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体)→加底物。底物的降解量=抗原量。
四.竞争法测定抗原
将抗体吸附在固相载体表面→加入酶标抗原→加入酶标抗原和待测抗原→加底物→对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。
ELISA操作步骤:
1. 包被抗原:用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔,每孔加200微升,37℃温育1小时后,4℃冰箱放置16~18小时。
2. 洗涤:倒尽板孔中液体,加满洗涤液,静放三分钟,反复三次,最后将反应板倒置在吸水纸上,使孔中洗涤液流尽。
3. 加封闭液200微升,37℃放置一小时。
4. 洗涤同2。
5. 加被检血清:用稀释液将被检血清作几种稀释,,每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。
6. 洗涤同2。
7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。
8. 洗涤同2。
9. 加底物:邻苯二胺溶液加200ml,室温暗处10--15分钟。
10. 加终止液:每孔50微升。
11. 观察结果:用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
仪器和材料:
1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)
2. 酶联免疫检测仪
3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000
4. 包被液:0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃,保存, Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml
5. 稀释液:0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, 4℃,保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20,0.5ml. 蒸馏水加至1000ml
6. ELISA洗涤液:同稀释液
7. 封闭液:0.5%鸡卵清蛋白,pH7.4 PBS
8. 邻苯二胺溶液(底物):临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O (7.163g/100ml) 6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升
9. 终止液:2mol/LH2SO4
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