ELISA免疫吸附法基本原理测试

ELISA基本原理：

1. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；

2. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；

3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

ELISA的分类：

一.直接法测定抗原

将抗原吸附在载体表面→加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物→加底物→底物的降解量＝抗原量。

二.间接法测定抗体

将抗原吸附于固相载体表面→加抗体, 形成抗原-抗体复合物→加酶标抗体； 加底物→测定底物的降解量＝抗体量。

三.双抗体夹心法测定抗原

将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面→加抗原，形成抗原-抗体复合物→加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物→加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）→加底物。底物的降解量＝抗原量。

四.竞争法测定抗原

将抗体吸附在固相载体表面→加入酶标抗原→加入酶标抗原和待测抗原→加底物→对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。

ELISA操作步骤：

1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。

2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。

3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。

4. 洗涤同2。

5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。

6. 洗涤同2。

7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。

8. 洗涤同2。

9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。

10. 加终止液：每孔50微升。

11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。

仪器和材料：

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板, 40, 96孔）

2. 酶联免疫检测仪

3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000

4. 包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml

5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml

6. ELISA洗涤液：同稀释液

7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS

8. 邻苯二胺溶液（底物）：临用前配制 0.1M 柠檬酸（2.1g/100ml）, 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　（7.163g/100ml）　6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升

9. 终止液：2mol/LH2SO4