温育是小鼠ELISA试剂盒测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37℃和室温,其次是43℃和2~8℃。目前国内售ELISA 试剂盒温育时间为37℃,30 min~1 进口ELISA试剂盒则通常为37℃,1~2 h 能有较完全的结合。
温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和(或)试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果是将微孔板一放入温箱即开始计时,这样就容易造成实际测定中温育时间不够,易致弱阳性标本测不出来。控制方法:
①如有两种温度,尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件
②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。
孵育前加样时间过长,酶试剂加出孔外,使用滴瓶滴加试剂时,滴加的角度不同和挤压的力度不同,致使滴加的试剂量不准,都可导致试验结果不准确。小鼠ELISA试剂盒控制方法:
①实验样本过多时,可分批次操作,以减少实验时间延长造成的误差;
②加酶试剂后,用吸水纸吸干孔外试剂;
③作定量试验时,使用加样器加注试剂,并经常校正其准确性,此外,要做到一份样本一个移液头,防止交叉污染。
使用96 孔板的ELISA测定中,外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96 孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴。
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