Western转膜缓冲液 （20x）

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖 - 磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极移动。

制备琼脂糖凝胶Western转膜缓冲液 （20x）

1 ．称 1. 2g 琼脂糖，加 100ml 电泳缓冲液（ 1×TAE ）加热熔化，取出摇匀，即为 1. 2% 的凝胶。

2. 当胶液冷至 60℃ 时，加 EB10μl ，小心混匀，缓慢倒入制胶模具中，在胶一端插上梳子。

3 ．待胶凝固后，拨出梳子，将模具置于电泳槽中，加入 1×TAE ，让液面高于胶面 2 -3mm 。

4 ．取 4ul 质粒，加 2ul lodaing buffer ， 6ulddH 2 O ，混匀，用加样器吸取样品。加入点样孔中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

5 ．接通电源， 1-5V/cm 电压，开始电泳。Western转膜缓冲液 （20x）

6 ．当溴酚兰染料移动到距离胶前沿 1 -50px 处，停止电泳。

7. 切断电源后，取出凝胶，在紫外灯（ 360nm 、 312nm 或 254nm ）下或经凝胶成像系统观察或拍照。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在 pH 值介于 12. 0-12. 5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 Ph4. 8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性时，共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕成网状结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA 、蛋白质 -SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

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