关注
已关注
已认证
粉丝量 0
400-860-5168转3389
仪器信息网认证电话，请放心拨打
如何判断反转录第一链cDNA合成成功
cDNA 在反转录界一直大名鼎鼎，但 TA 鲜少抛头露面！那我们怎样才能辨别出 TA 的身份呢？按理来说，RNA 的质量没问题（28 s 和 18 s rRNA 清晰、明显，亮度比符合 2:1），那么反转录产生的 cDNA 一般是不会出现问题的。
(来源于网络）
和小编一起来听听学霸们怎么说？
一般都可以用电泳检测是否合成适当大小片段的带，如果你是想看它的大小肯定可以，如果想看他碱基有没有出错当然还是测序或者使用探针检测，就是比较麻烦。
用PCR检测合成的cDNA中管家基因的量，如果出现比较好条带，基本可以证实你的cDNA没有问题，我们实验室一致这样控制。
如果不怕烦的话，可以在转第一链时加入少量同位素标记的dNTP，然后看一下放射比活度或做个放射自显影。也可在合成双链后跑电泳看一下。
做内参照啊！如GAPDH,β－actin,β-MG等。
这么多学霸出谋划策，你，懂了吗？
那小编给大家做了总结，汇报如下，请各位霸霸查收～
选择试剂盒：您做反转录实验想得到什么样的产物？
如何检测第一链cDNA合成成功？
取约5ul反应产物，在1%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，紫外成像检测，呈现出大小在200-10Kb的拖带，其中重心区域小1-4Kb之间，这说明反转录完全，得到了高质量的cDNA
全长双链cDNA做分子克隆实验，然后通过测序结果精确判断。
Oligo(dT)18和Random Primers按比列使用可解决poly(A) mRNA模板限制和长度限制的问题
序列特异性引物可获得你想要得目的序列
探针检测
qPCR或RT-qPCR步骤
管家基因/内参基因
以反转录产物为模板，扩增内参基因，扩增有结果，说明cDNA的质量基本可以保证，这个方法限制于随机引物扩增（因为管家基因片段多数较短）。
而Oligo(dT)18与序列特异性引物扩增或我们做LD PCR（2kb、10kb等长片段）时，这些内参扩增的几率远大于全长或大片段cDNA的扩增，这时可能就无法通过内参来检验cDNA扩增结果的好坏。
同位素标记
反转录中加入少部分同位素标记的dNTP
放射比活度或放射自显影检测
更多
细胞百科之鳞状上皮细胞
厂商
2023.11.17
细胞常见问题之细胞培养中遇到细胞空泡化怎么办？
厂商
2023.10.17
细胞百科之----Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）
厂商
2023.09.12
开学大促 | 惊喜“爆”到！
厂商
2023.09.08
企业名称： 上海沪震生物科技有限公司
企业地址： 上海市杨浦区密云路1018号复旦科技园808室 联系人： 陈环环 邮编： 200613 联系电话： 400-860-5168转3389
仪器信息网APP
展位手机站