洗涤ELISA平板的技巧

2015-01-19 18:20

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洗涤参数一些参数会影响洗涤步骤的效果。第一个主要的参数是洗涤量。自动洗板机会分配洗涤液。如果你之前遭遇过高背景，那么不要犹豫，将洗涤量调为高，最好是比包被体积更高。太少的洗涤液会让一部分分析表面洗涤不到，从而明显增加背景。所有反应孔的洗涤量必须相同。ELISA板的制造商通常会在试剂盒的使用手册中列出包被量。行业中通常使用的包被量是200 μl。如果你的试剂盒也是这样，那么制造商可能会建议使用300 μl洗涤液进行洗涤，以便清洁整个反应孔的壁。一般来说，洗涤量越高，则孵育步骤残留的抗体或抗原量就越少。洗涤次数的经验法则第二个影响洗涤效果的主要参数是洗涤循环的量。当然，洗涤次数越多，背景越低。然而，太多次的洗涤会降低信号强度，使其难以测定。通常的做法是在每次抗体或抗原孵育后重复洗涤三次。不过，ELISA板的制造商会对洗涤次数提出建议。一般而言，制造商包被平板需要的洗涤次数比用户包被的平板要少。对于用户包被的ELISA板，必须优化洗涤次数。控制洗涤量和洗涤次数的另一种方法是加入过量的洗涤液。一般来说，96孔板的每个孔能容纳330至460 μl。不过，有些自动化洗板机可设置程序，分配远远超出这个量的洗涤液，比如1 ml。它是如何做到的呢？其实很简单，就是在分液的同时打开吸液功能。换句话说，随着分液器分配更多的液体，抽吸器也将液体吸出。这种技术能增加洗涤量，但不会溢出到其他孔中。抽吸另外，还有一些参数会影响洗涤步骤的效果。这些参数包括吸液高度和吸入位置，这两者都能调整，以降低背景（残留量）和差异。残留液体中包含未结合的抗原或抗体，它们会增加背景信号。残留量越小，残留液体越少，转移到下一步的干扰液体也就越少。吸液高度会明显影响残留量；如果洗涤吸头与反应孔底部的距离稍大，那就会让残留量急剧增加。反之，如果洗涤吸头压着反应孔底部，那么也会使吸液效率降低，残留量增加。目前的洗板机一般使用两种类型的洗头：刚性和浮动的。浮动洗头中的吸头可在洗涤过程中自由上下移动，而刚性洗头则固定在适当的位置。使用刚性洗头的洗涤操作在优化起来更为复杂，因为你需要非常仔细地调整吸液高度。如果你们实验室使用几种不同的板，那可能会很耗时。在使用浮动洗头时，吸头会降到反应孔的底部。调整高度就不是很重要，因此洗头会下降到底部。抽吸的位置也对残留量有着重要影响；如果每个孔只使用一个抽吸点（这很常见，因为更快），那么抽吸的位置需要优化。最佳的位置取决于洗头的性状，但它几乎不在反应孔的中间，即使这是所有洗头最常见的默认位置。一般来说，最佳位置在孔中间与孔壁之间的某处。

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