细菌的芽孢染色法

一、实验目的和要求

(1)学习并掌握芽孢染色法。

(2)初步了解芽孢杆菌的形态特征。

二、基本原理

芽孢又叫内生孢子(endospore)，是某些细菌在一定的环境下生长到一定阶段在菌体内形成的含水量低、壁厚、抗逆性强的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用苯酚复红，结晶紫等进行单染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椭圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。

芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或苯酚复红在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内；进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱；当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

三、实验材料与设备

1．菌种

蜡样芽孢杆菌约2d营养琼脂斜面培养物、球形芽孢杆菌1～2d营养琼脂斜面培养物。

注意：所用菌种应掌握茵龄，以大部分细茵已形成芽孢囊为宜；取茵不宜太少。

2．染色剂

5％孔雀绿染液、0．5％番红水溶液。

孔雀绿染液：孔雀绿5g、蒸馏水100mL。

齐氏苯酚复红染色液：A液成分为碱性复红0．3g、乙醇(95％)10mL，B液成分为苯酚5．0g、蒸馏水95mL。将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95％乙醇，继续研磨使其溶解，配成A液。将苯酚溶于水中，配成B液。混合A液及B液即成苯酚复红染液。通常可将此混合液稀释5～10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。

3．仪器或其他用具

小试管、滴管、烧杯、试管架、载玻片、木夹、显微镜等。

四、操作步骤

1.改良的舍弗勒一富尔顿染色法

1)制备菌悬液

加1～2滴水于小试管中，用接种环挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。

2)染色

加孔雀绿染液2～3滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15～20min。

3)涂片固定

用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。

4)脱色

水洗，直至流出的水无绿色为止。

5)复染

用番红染液染色2～3min，倾去染液并用滤纸吸干残液。

6)镜检

干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

2.舍弗勒-富尔顿染色法

1)制片

按常规涂片、干燥、固定。