2019/02/25 15:37
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方案摘要:
产品配置单:
碱裂解溶液Ⅲ(制备质粒)
型号: 100ml
产地:
品牌: 远慕
面议
参考报价
PET-32a(+)质粒
型号: 2ug
产地:
品牌: 远慕
¥1
参考报价
pBR322质粒
型号: 5ug
产地:
品牌: 远慕
¥1
参考报价
方案详情:
琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:
1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.
2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加
1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.
3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).
4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.
(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.
(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存
(二)试剂
1.l DNA/HindIII分子量标准
2.溴酚蓝指示剂点样缓冲液
0.2% 溴酚蓝
50% 蔗糖
3.1mg/ml溴化乙锭溶液
4.电泳缓冲液(TAE)
40 mmol/L Tris-乙酸
1 mol/L EDTA
(配制方法:24.2克Tris碱,5.71ml冰乙酸,10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容至5000ml)
5.0.7% 琼脂糖凝胶
(配制方法:称取琼脂糖0.35克,加入50ml TAE电泳缓冲液)
(三)仪器
微量移液器 电泳仪
水平电泳槽 透射紫外观察仪
实验步骤
1.选择合适的水平式电泳槽,调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。
2.选择孔径大小合适的点样梳子,垂直架在电泳胶模的一端,使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。
3.制备0.7%琼脂糖凝胶,100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。
4.用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好,防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时,加入一滴溴化乙锭,摇匀,轻轻倒入电泳胶模中,琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。
5.琼脂糖凝胶凝固后,在室温放置20分钟,小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板,保持点样孔的完好。
6.将电泳胶模放入电泳槽中,加入电泳缓冲液,使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1~2mm。如点样孔内有气泡,用吸管小心吸出,以免影响加样。
7.将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度,使样品均匀沉到样品孔内,还可以使样品带颜色,便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。
8.用微量移液器将样品小心加入加样孔内,记录样品点样秩序。
9.盖上电泳槽,开启电源开关,最GAO电压不超过5V/cm(100~150V恒压电泳),使DNA从负极向正极移动。
10.电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1~3小时。电泳完毕后关闭电源,戴一次性塑料手套取出凝胶,尽可能将所有的电泳缓冲液淋干,在254nm波长的透射紫外灯下观察。
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