荧光定量PCR体系各种加样问题解答

PCR反应体系中,各试剂加样量是如何确定的，DNA模板怎么提取，PCR体系。这个小小管子里都有什么东西、需要加多少呢？今天一起来看一下关于PCR体系的加样各种问题。

关于体系

PCR技术问世于上世纪80年代。问世之初的PCR体系比较大，动辄以毫升计。现在的PCR体系要精巧多了，总体积可大可小。我们常接触到的常规PCR以及荧光定量PCR的体系一般都在几十微升，小到可以10微升左右。

早期的PCR体系，里面的组分都是各自独立加样的，包括DNA模板、上游引物、下游引物、dNTP、Buffer、MgCl2、聚合酶、水。所以早年间做一管PCR需要加样7——8次才能加完一管。现在就简化多了。除了特异的 DNA模板与引物以外，其他几种成分可以做到混在一起，做为PCR Mix统一加样。这样每个管一般只需做4次加样操作即可完成，工作量减少近一半。

DNA模板来源

DNA模板一般来自于从组织中提取的DNA、或者从RNA逆转录得到的cDNA。很多经验表明，逆转录得到的cDNA一般要稀释10倍再做荧光定量PCR，这样得到的CT值会在一个比较理想的范围内。当然这并不是固定的做法，还要根据你的实际情况来做调整。用于PCR的引物浓度，比较常用的是10 p mol/ul、等于10 uM。注意单位哦。

PCR mix

PCR Mix由于已经是现成的，所以你不必调节里面的组分。放心，组分肯定是够用的。因为在一个PCR体系内，引物和dNTP、酶等都是足量甚至过量的。当然PCR Mix并不是简单的把那几种成分一古脑混在一起就行的，里面还需要特殊成分以维持其稳定性。对于荧光定量PCR用的Mix，里面还会预混有荧光染料。

dna

如果你对DNA聚合酶有特殊要求，不想简单的采用PCR Mix，那么你可以单独选择你要的那种酶，以及相应的其他组分相配合。

关于体系中的水

水是用于补齐总体积的。PCR由于成分多、各成分又有不同体积，所以加起来的总体积可能并不刚好是理论上的总体积。计算总体积一般要参考其中的Buffer的体积。如果是10 x Buffer，那么总体积就应该是10 x Buffer体积的10倍。如果达不到这么多，就加水补齐。如果PCR Mix以及模板和引物的总体积是刚好的，就可不必加水了。

早年的PCR体系往往还要加另一种成分：液体石蜡油。在PCR总体系配制完成后，最后再在上面加一层液体石蜡油。液体石蜡油比较轻，会漂浮在上面，可防止体系中的水分挥发。这是一种简单但很实用的做法。现在的PCR管密封很好，又有完善的热盖系统，所以这种做法现在已经不太常见了。