标准溶液是化学实验室用于分析工作的标准试剂的总称，标准滴定溶液是确定了准确浓度用于滴定分析的一种溶液。如何制备标准滴定溶液并保证其浓度的准确性是保证试样分析结果准确性的基础。　　　　标准溶液如何配置？制备标准溶液过程中需注重哪些问题？标准滴定溶液制备误差是什么？如何消除误差？远慕为你一一解读！　　　　对试剂和水的要求　　　　(1)试剂的纯度应在分析纯以上，且性质稳定，配成的溶液不易挥发和起其他变化。标定标准溶液必须用基准试剂。　　　　(2)配制标准溶液的实验用水应符合GB/T 6682中三级水的规格。　　　　标准溶液的配制与标定　　　　标准溶液在配制与标定过程中需注重的问题有哪些？　　　　（1）溶液配制中所用的水，在没有注明其它要求时，应符合GB/T 6682中三级水规格。　　　　（2）标定溶液和配制基准溶液所用试剂为容量分析基准试剂。配制一般溶液所用试剂纯度不低于分析纯。　　　　（3）溶液配制中使用的分析天平、滴定管、单标线容量瓶及单标线吸管等需按计量检定规程要求检定或校准。单标线容量瓶、单标线吸管应有容量校正因子。　　　　（4）称量工作基准试剂的质量小于或等于0.5g时，按精确至0.01mg称量；大于0.5g时，按精确至0.1mg称量。　　　　（5）标定标准滴定溶液浓度时，需两人进行实验，分别做四平行，每人四平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.15%，两人共八平行标定结果相对极差不得大于相对重复性临界极差0.18%。　　　　（6）在运算过程中保留5位有效数字，取两人八平行标定结果的平均值为标定结果，报出结果取四位有效数字。　　　　（7）制备标准滴定溶液的浓度应在规定浓度的±5%范围以内。　　　　举个例子：　　　　（一）氢氧化钠标准溶液的配制和标定　　　　一．目的要求　　　　1.掌握NaOH标准溶液的配制和标定。　　　　2.掌握碱式滴定管的使用，掌握酚酞指示剂的滴定终点的判断。　　　　二．方法原理　　　　NaOH有很强的吸水性和吸收空气中的CO2，因而，市售NaOH中常含有Na2CO3。　　　　反应方程式：2NaOH+CO2→Na2CO3+H2O　　　　由于碳酸钠的存在，对指示剂的使用影响较大，应设法除去。　　　　除去Na2CO3最通常的方法是将NaOH先配成饱和溶液（约52%，W/W），由于Na2CO3在饱和NaOH溶液中几乎不溶解，会慢慢沉淀出来，因此，可用饱和氢氧化钠溶液，配制不含Na2CO3的NaOH溶液。待Na2CO3沉淀后，可吸取一定量的上清液，稀释至所需浓度即可。此外，用来配制NaOH溶液的蒸馏水，也应加热煮沸放冷，除去其中的CO2。　　　　标定碱溶液的基准物质很多，常用的有草酸（H2C2O4•2H2O）、苯甲酸（C6H5COOH）和邻苯二甲酸氢钾（C6H4COOHCOOK）等。最常用的是邻苯二甲酸氢钾，滴定反应如下：　　　　C6H4COOHCOOK+NaOH→C6H4COONaCOOK+H2O　　　　计量点时由于弱酸盐的水解，溶液呈弱碱性，应采用酚酞作为指示剂。　　　　三．仪器和试剂　　　　仪器：碱式滴定管（50mL）、容量瓶、锥形瓶、分析天平、台秤。　　　　试剂：邻苯二甲酸氢钾（基准试剂）、氢氧化钠固体（A.R）、10g/L酚酞指示剂：1g酚酞溶于适量乙醇中，再稀释至100mL。　　　　四．操作步骤　　　　1.0.1mol/L NaOH标准溶液的配制　　　　用小烧杯在台秤上称取120g固体NaOH，加100mL水，振摇使之溶解成饱和溶液，冷却后注入聚乙烯塑料瓶中，密闭，放置数日，澄清后备用。　　　　准确吸取上述溶液的上层清液5.6mL到1000毫升无二氧化碳的蒸馏水中，摇匀，贴上标签。　　　　2.0.1mol/L NaOH标准溶液的标定　　　　将基准邻苯二甲酸氢钾加入干燥的称量瓶内，于105～110℃烘至恒重，用减量法准确称取邻苯二甲酸氢钾约0.6000克，置于250mL锥形瓶中，加50mL无CO2蒸馏水，温热使之溶解，冷却，加酚酞指示剂2～3滴，用欲标定的0.1mol/LNaOH溶液滴定，直到溶液呈粉红色，半分钟不褪色，同时做空白试验，要求做三个平行样品。　　　　五．结果结算　　　　NaOH标准溶液浓度计算公式：　　　　m CNaOH = （V1-V2）×0.2042　　　　式中：　　　　m---邻苯二甲酸氢钾的质量，g　　　　V1---氢氧化钠标准滴定溶液用量，mL　　　　V2---空白试验中氢氧化钠标准滴定溶液用量，mL　　　　0.2042---与1mmol氢氧化钠标准滴定溶液相当的基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g　　　　（二）盐酸标准溶液的配制和标定　　　　一．目的要求　　　　1.掌握减量法准确称取基准物的方法。　　　　2.掌握滴定操作并学会正确判断滴定终点的方法。　　　　3.学会配制和标定盐酸标准溶液的方法。　　　　二．原理　　　　由于浓盐酸容易挥发，不能用它们来直接配制具有准确浓度的标准溶液，因此，配制HCl标准溶液时，只能先配制成近似浓度的溶液，然后用基准物质标定它们的准确浓度，或者用另一已知准确浓度的标准溶液滴定该溶液，再根据它们的体积比计算该溶液的准确浓度。　　　　标定HCl溶液的基准物质常用的是无水Na2CO3，其反应式如下：　　　　Na2CO3＋2HCl →2NaCl＋CO2＋H2O滴定至反应完全时，溶液pH为3.89，通常选用溴甲酚绿—甲基红混合液作指示剂。　　　　三．试剂　　　　1.浓盐酸（密度1.19）　　　　2.溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂：量取30mL溴甲酚绿乙醇溶液（2g/L），加入20mL甲基红乙醇溶液（1g/L），混匀。　　　　四．步骤　　　　1．0.1mol·L 1HCl溶液的配制　　　　用量筒量取浓盐酸9mL，倒入预先盛有适量水的试剂瓶中，加水稀释至1000mL，摇匀，贴上标签。　　　　2．盐酸溶液浓度的标定　　　　用减量法准确称取约0.15g在270~300℃干燥至恒量的基准无水碳酸钠，置于250mL锥形瓶，加50mL水使之溶解，再加10滴溴甲酚绿-甲基红混合液指示剂，用配制好的HCl溶液滴定至溶液由绿色转变为紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。由Na2CO3的重量及实际消耗的HCl溶液的体积，计算HCl溶液的准确浓度。　　　　五．注意事项　　　　干燥至恒重的无水碳酸钠有吸湿性，因此在标定中精密称取基准无水碳酸钠时，宜采用“减量法”称取，并应迅速将称量瓶加盖密闭。　　　　在滴定过程中产生的二氧化碳，使终点变色不够敏锐。因此，在溶液滴定进行至临近终点时，应将溶液加热煮沸，以除去二氧化碳，待冷至室温后，再继续滴定。　　　　还有氧化还原标准溶液的配制和标定呢！　　　　氧化还原滴定法是以氧化还原反应为基础的容量分析方法。由于氧化还原反应类型不同，所以标准溶液比较多。高锰酸钾法以KMnO4为标准溶液；重铬酸钾法以K2Cr2O7为标准溶液等。下面着重讲一下高锰酸钾标准深溶液的配制和标定。　　　　①高锰酸钾是一个强氧化剂，易受还原性杂质和有机杂质影响，所以KMnO4浓溶液配制后应加热煮沸，使各种还原物质完全氧化，再滤去杂质，静置15天，存放于棕色瓶中。　　　　②高锰酸钾标准溶液的酸度要适当。酸度应保持在1mol/L左右，酸度过低，则MnO-4部分还原为MnO2，析出棕色沉淀，过高使基准Na2C2O4分解。　　　　③温度要适当。将溶液温度加热到65℃左右可加速反应。当温度超过90℃时，在酸性溶液中会造成KMnO4、C2O42-分解;温度低于60℃时反应速度太慢。　　　　④滴定速度要适当掌握。滴定开始时KMnO4反应很慢，应等第一滴红色消失后再加第二滴。溶液中产生了Mn2+后，由于Mn2+的自催化作用,滴定速度可加快，但不能成线，以防止MnO-4分解。滴定到红色在30秒内不消失为止，作为终点。　　　　标准溶液保存　　　　(1)标准溶液应在室温20±5℃下存放，不要放在有加热设备的房间里。　　　　(2)标准溶液不应放在有酸碱和氧化还原性逸出气的环境中，应在瓶塞上加装过滤空气中杂质的保护管。酸标准溶液加酸石棉保护管以吸收碱性气体；碱标准溶液加碱石棉保护管，以吸收酸性气体。　　　　(3)易挥发，见光易分解的标准溶液应装在棕色瓶中，避光存放。　　　　(4)不能用吸液管直接从标准溶液中吸取标准液。　　　　(5)标准溶液在常温下保存不得超过两个月，氧化还原溶液一般一个月。　　　　总之，标准溶液在配制、标定、保存和使用过程中，要认真按规定进行各环节的工作，才能保证溶液浓度的准确性，以保证实验结果的真实、准确。　　　　小结：容量分析法中，以滴定分析用标准溶液对试样中欲测组分进行滴定，根据标准溶液的消耗量和浓度进行结果计算。因此标准溶液浓度的准确性对测试结果有直接的影响。所以在标准溶液的配制、标定和使用中要注意遵守注意事项哦！　　　　以上内容仅供参考，具体标准溶液配制及滴定方法请参考GB/T 601-2016 化学试剂标准滴定溶液的制备！

　　1、从物品、用品消毒灭菌着手　　　　细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒 30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml的饱和硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。　　　　2、添加抗生素　　　　各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。　　　　3、从操作者做起　　　　（1）进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。　　　　（2）操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。　　　　（3）操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。　　　　（4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。　　　　（5）操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。　　　　（6） 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。　　　　4、防止细胞交叉污染　　　　所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。　　　　5、无菌室的彻底消毒　　　　1） 新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室。使用前应稀释即配即用。新洁尔灭和酒精相比，最大的优点是便宜，因为新洁尔灭500ml只需5元，而且可以稀释50倍用，而同样量的酒精价格可能是新洁尔灭的几十倍。　　　　2）甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。甲醛价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。　　　　其主要用法为：　　　　a）熏蒸消毒：每立方米空间甲醛用量为10~15毫升，熏蒸消毒时应密闭门窗封闭至少4h以上。高锰酸钾加40%甲醛（1:1）混合后放入一开发容器中，立即可见白色甲醛烟雾。消毒后可放入25%氨水蒸发中和刺激气味。氨水用量为所用甲醛水溶液的一半，时间为30分钟。甲醛气体毒性非常强，所以操作时一定需带上防毒面具。　　　　b）自然挥发： 将较大量的甲醛水溶液放入一敞开容器中，室内温度保持在18摄氏度以上，同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上，经16小时可达到室内消毒的目的

　　实验方法原理：本染色法是最基本的染色法，可使用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。　　　　实验步骤    　　　　一、实验试剂：　　　　1. 结晶紫溶液：　　　　A液：结晶紫：2g，95%乙醇：20ml。　　　　B液：草酸铵：0.8g，蒸馏水：80ml。　　　　需在用前24小时将A液. B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。　　　　2. 碘液：　　　　碘：1g，碘化钾：2g蒸馏水：300ml。　　　　出碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继  续加入少量蒸馏水至完全溶解，最后补足水量。　　　　也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。　　　　3. 脱色液：95%乙醇。　　　　4. 复染液：　　　　A.贮存液：沙黄：2.5g，95％乙醇：100ml。　　　　B.应用被：A液：10ml，蒸馏水：90ml。　　　　菌片制备：染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环蘸取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布，菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑去菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不易过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。　　　　二、染色方法：　　　　l. 涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。　　　　2. 加碘液染1min，水洗。　　　　3. 加脱色液，不时摇动约30秒，至无紫色脱落为止，水洗。　　　　4. 加复杂液，染30秒，水洗。　　　　5. 干后镜检。

冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取在原理上并没有显著的区别，两者都可以采用类似的方法进行RNA的提取。以下是关于两者RNA提取的详细比较：一、操作步骤相似性1.细胞裂解：无论是冻存细胞还是新鲜细胞，都需要通过细胞裂解来释放细胞内的RNA。这通常使用裂解缓冲液来破坏细胞膜和细胞核，使RNA能够被释放出来。2.RNA的释放：在细胞裂解的过程中，RNA会被释放到裂解液中。为保持RNA的完整性，应避免使用酶来降解RNA，并控制温度和pH值。3.RNA的纯化：裂解后，需要对裂解液进行纯化，以去除其他杂质和污染物。常用的纯化方法包括酚/氯仿法或硅胶柱纯化法。4.RNA的保存：提取纯化后的RNA应尽快保存起来，以防止其降解。常见的保存方法是在-80的低温冰箱中冻存RNA或使用RNA保存液进行长期保存。二、注意事项1.细胞裂解缓冲液的选择：应根据细胞类型和实验要求来确定裂解缓冲液的选择。2.RNA的完整性保护：在细胞裂解和RNA释放的过程中，应尽量避免RNA的降解，如控制温度和pH值等。3.纯化过程中的污染控制：在纯化RNA的过程中，应注意避免污染和杂质的引入，采用无菌操作，避免外源性RNA的污染。三、冻存细胞与新鲜细胞RNA提取的细微差别虽然两者在操作步骤和注意事项上大体相同，但冻存细胞在提取RNA时可能会受到冻存过程的影响，如细胞破裂或核酸降解等。这可能导致在提取核酸时出现一定程度的损失，影响核酸的纯度和完整性。然而，这种影响通常可以通过优化实验条件来减少。综上所述，冻存细胞与新鲜细胞的RNA提取在原理和方法上大体相同，但冻存细胞可能会受到冻存过程的影响。在实际操作中，应根据具体情况选择合适的实验条件和方法来确保RNA提取的质量和效率。

抗酸染色的基本原理：分枝杆菌的植物细胞内带有很多的脂类，包围着在肽聚糖的外边，因此分枝杆菌一般不容易上色，要历经加温和增加上色时间来促进其上色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染剂融合后，就难以被酸碱性脱色剂褪色，故称抗酸染色。齐-尼氏抗酸染色法是在加温标准下使分枝菌酸与石炭酸复红坚固融合成一氧化氮合酶，用盐酸乙醇解决都不褪色。当再加偏碱美兰复染后，分枝杆菌依然为鲜红色，而别的病菌及情况中的物质为深蓝色。制片：（1）涂片：左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈）即可，或先滴一小滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面上挑出少许，与载玻片上的水滴混合均匀，涂成一薄层。 拔或塞试管塞时，应将试管口通过火焰略加烧灼，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰。（3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色。染色：（1）初染：滴加石炭酸复红溶液2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热5分钟，待标本冷却后用水冲洗。（2）脱色：（3）复染：用碱性美兰溶液复染1分钟，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察:1、油不要滴太多2、在调节焦距的时候要特别注意与载玻片之间的距离不要弄坏工具3、调节时应该从下往上调节4、在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将需进一步放大的部分移到视野的中心。5、用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。6、油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。结果判定:1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色2. 报告方式2.1 未找到抗酸杆菌2.2 找到抗酸杆菌±：可疑，发现抗酸杆菌1-2条/300视野2.3 找到抗酸杆菌1+：发现抗酸杆菌3-9条/100视野2.4 找到抗酸杆菌2+：发现抗酸杆菌1-9条/10视野2.5 找到抗酸杆菌3+:发现抗酸杆菌1-9条/1视野2.6 找到抗酸杆菌4+：发现抗酸杆菌≥10条/1视野质量控制：每次用卡介苗做阳性对照大肠埃希菌ATCC25922做阴性对照注意事项：1.每一玻片只能涂一份标本，以防脱落混淆2. 脱色时间需根据涂片厚薄而定，厚片可适当延长，以无红色脱出为止3. 冬季室温过低时，染色时间要适当延长4. 有时同一个抗菌体上红色深浅也有不同，观察时应注意5. 每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发，储存时应避免高、低温及阳光照射6. 在涂抹痰标本时，严禁对玻片加热7. 染色时勿使玻片上的染液干燥

　　多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆，产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。　　　　一、单多抗优缺点　　　　多克隆抗体优点　　　　1.多克隆抗体有助于放大低表达水平的靶蛋白信号；　　　　2.能识别多个表位；　　　　3.比单克隆抗体更能容许抗原中的微小变化；　　　　4.识别出与免疫原蛋白质具有高同源性的蛋白质，或者从非免疫原物种的组织样品中筛选靶蛋白；　　　　5.多克隆抗体通常是检测变性蛋白质的首选；　　　　6.多表位通常可提供更为有力的检测。　　　　多克隆抗体缺点　　　　1.易于产生批次间差异；　　　　2.产生大量非特异性抗体，有时可能在某些应用中产生背景信号；　　　　3.不适用于探测抗原的特定结构域，因为抗血清通常可识别多个结构域。　　　　单克隆抗体优点　　　　1.杂交瘤制得后，就成为了恒定的再生源，所有批次都将相同；　　　　2.切片和细胞染色造成的背景较低。　　　　3.具有特异性，适于分析测定中的一抗或检测组织中的抗原，并且通常所产生的背景染色显著低。　　　　4.同质性非常高；　　　　5.单克隆抗体的特异性能使其在混合物中和抗原高效地结合。　　　　单克隆抗体缺点　　　　1.可产生大量特异性抗体，但可能特异性过强；　　　　2.经过抗原的化学处理后比多克隆抗体更易于丢失表位。这可通过使用同一抗原的两个或多个单克隆抗体进行补偿。　　　　二、单抗和多抗的选择　　　　如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（WB/IP/IF/ICC等)，可以选择制备单克隆抗体。　　　　多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在WB 中有杂带，在IHC 中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。另外多抗需要免疫原的量大，如果免疫原制备困难，建议制备单抗。　　　　若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做ELISA检测，可以选择制备多克隆抗体。　　　　多抗相比较单抗仍然有制备时间短、首次制备成本低的特点，在一些情况下也是一种选择。另外，在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。　　　　三、抗原的选择　　　　抗原的选择可以是天然蛋白、重组可溶蛋白、重组变性蛋白和多肽，抗原质量越高，最终制备高质量抗体的几率也会越大！ 目前抗体制备常采用重组蛋白或多肽作为抗原。　　　　常规情况下，重组蛋白作为抗原往往含有更多的抗原决定簇，既有空间表位，也会有线形序列表位，对于机体的免疫刺激也会相对充分一些，那么最终获取应用面较广的抗体几率也会大很多，尤其是目的蛋白已证明有修饰或者复杂结构的，一般都会优先选择重组蛋白。　　　　当然也有必须用多肽制备的，比如对同源家族某一个蛋白抗体的制备，同源性非常高的，需要找到特异性aa合成多肽，再或者一些修饰化抗体，需要在多肽合成阶段定点修饰某些AA来制备抗体。　　　　抗原多肽选择一般遵循如下基本原则　　　　1.尽可能是在蛋白表面；　　　　2.保证该段序列不形成α-helix；　　　　3.N，C端的肽段比中间的肽段更好；　　　　4.避免蛋白内部重复或接近重复段的序列；　　　　5.避免同源性太强的肽段；　　　　6.交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端；　　　　7.序列中不能有太多的Pro，但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。

融合剂细胞融合的方法有物理法，如电融合、激光融合，化学融合法和生物融合法，如灭活的仙台病毒，此处例举化学融合法中的一种即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量为200～700时，呈无色、无臭的粘稠状液体，分子量大于1000时，呈乳白色蜡状固体，能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂，对热稳定，与许多化学药品不起作用。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。50%浓度，pH偏碱时融合效应最高。也有采用30%～50%浓度的PEG加上10%二甲亚砜。不同批号的PEG，即使分子量相同，但融合率却有明显差异，选用时必须注意。每批都必须进行细胞毒性试验后方可应用。要买高纯度的，一般选供气相色谱用的PEG。融合过程融合的方法很多，常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1:1至10:1不等。3:1或5:1最为常用。1．试剂与材料(1)供融合用的脾细胞及骨髓瘤细胞。(2)1640培养液100ml。(3)完全1640液100ml。(4)2.5%FCS－1640液50ml。(5)HAT培养液100ml。(6)50%PEG：取分子量4000，高纯度的（日本进口或Serva）PEG10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前用预热于40℃的1640液10ml等量（W/V）混合，以酚红检查pH，一般不必调pH。如pH有改变，可用HCl或NaHCO3调整。(7)10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。(8)40孔塑料培养盘。2．操作方法⑴准备好脾细胞。⑵在50ml沉淀管中混合108脾细胞和107小鼠骨髓瘤细胞，并加入50ml2.5%FCS－1640液。⑶室温400g离心3min，使细胞沉淀。⑷移去上清液。⑸轻敲管底部，使沉淀流动，把沉淀管放于40℃水浴中，使其达融合温度。⑹加预热至40℃的50%PEG0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，边加边摇沉淀管，肉眼观察可见有颗粒出现，滴加过程要求持续2min。⑺加1ml1640液，边加边摇动，持续1min。⑻重复⑺一次。⑼加1ml1640液，边加边摇动，持续0.5min。⑽重复⑼一次。⑾加1640液15ml。⑿室温，400g离心1min，使细胞沉淀。⒀去上清，轻敲管底部，加25ml含有HAT的完全1640液。⒁往已于前一日种有饲养细胞的40孔塑料培养盘中滴加融合的细胞液，每孔1滴（约0.05ml）。⒂轻摇后，放入5%CO2饱和湿度的37℃温箱中培育。⒃第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要加入适量的饲养细胞。⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在10~20天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。⒅对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS－1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。细胞融合关键1．技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。2．融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个无毒无菌的操作环境。

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：　　　　一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。　　　　二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。　　　　三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。　　　　四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。　　　　根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。　　　　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步法检测。　　　　在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。　　　　假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，显然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。　　　　双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而可消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。　　　　双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。　　　　反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

培养基与菌种分离培养基与菌种分离是从含有多种微生物的样品中获得纯种微生物的操作技术。菌种分离主要在培养皿上进行，常用的方法是稀释法和划线法。使用这两种方法的目的是是微生物的一个个体通过繁殖，在固体培养基上长出肉眼能见的群体，根据培养特征，用接种针调取所需菌种并在显微镜下检查，证明为单一形状的菌体。常用的培养基是选择培养基。如分离分解纤维素的微生物用的培养基是以纤维素为碳源的培养基，因为从这种培养基上长出来的只能是分解纤维素的微生物。细菌的纯种分离和接种技术中，需要注意的事项有：稀释度的问题纯种分离的时候，无非是把菌液稀释一定梯度后，涂布在诸如LB培养基上。如果没有稀释好，就会导致细菌长得太密，或者是细菌根本不长。最优的稀释梯度是最后在平板上的菌落数在30至300之间。此时，能清楚地看清菌落的形态，便于挑取单菌落。基本形态与大小有以下几种类型：①单球菌：单独存在，如尿素小球菌；②双球菌：如肺炎双球菌；③链球菌：如乳酸链球菌；④四联球菌：形成的4个细胞排列在一起，成田字，如四联球菌；⑤八叠球菌：如尿素生孢八叠球菌；⑥葡萄球菌：如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。长宽相差较大的棒杆状或长杆状菌，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、梭状杆菌（Bacterium fusiformis）；分枝状或叉状菌，如双歧杆菌属（Bifidobacterium）；竹节状（两端平截），如炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）等。

甘油菌种复苏保存涉及几个关键步骤，‌包括菌种的保存、‌复苏以及再次保存的过程。‌以下是详细的步骤和注意事项：‌菌种保存：‌将菌种接种于LB液体培养基，‌并在对数生长期时，‌当培养体系内浑浊可见时，‌进行保存。‌准备50%浓度的甘油溶液，‌可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合得到。‌在无菌条件下，‌将菌液与50%浓度的甘油按1:1的比例混合，‌使甘油终浓度达到25%。‌将混合液转移至2ml离心管中，‌并在-20°C冰箱内保存。‌这种条件下，‌菌种的保存有效期为1年。‌若需长期保存，‌建议在-70°C或-80°C下冻存，‌保藏时间一般为2-4年左右12。‌菌种复苏：‌在使用前，‌将保存的菌种在30°C水浴中解冻。‌解冻后，‌将菌液接种到固体培养基上，‌并在适宜条件下培养24-48小时，‌以恢复菌种的活性。‌再次保存：‌复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，‌并再次进行甘油保存。‌这一过程确保了菌种的长期保存和可用性。‌注意事项：‌确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，‌以避免污染。‌在操作过程中保持无菌条件，‌以防止外界微生物的污染。‌正确的保存和复苏方法对于保持菌种的活性和纯度至关重要。‌保存的温度对菌种的长期存活有很大影响，‌低温条件有利于延长保存时间。

（一）核糖核酸酶A核糖核酸酶A（RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是3’嘧啶核苷酸和末端带3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。无辅助因子及二价阳离子存在时，核糖核酸酶A的作用可以被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒一核糖核苷复合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNase A的反应条件极广，且极难失活。在低盐浓度（0～100 mmol/l NaCl）下，RNase A切割单链和双链RNA、DNA：RNA杂交体中的RNA；当NaCl浓度为300 mmol/l。或更高时，RNase A就特异性切割单链RNA。去除反应液中的RNase A，通常需要蛋白酶K处理、酚反复抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途为：①从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。②确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA杂交体中，若存在单碱基错配，可用RNAse A识别并切割。通过凝胶电泳分析切割产物的大小，即可确定错配的位嚣。③RNA检测。RNA酶保护分析法（RNase protection assay）是近年来发展起来的一种检测RNA的杂交技术。其基本原理是利用单链RNA探针，与待测的RNA样品进行杂交形成RNA：RNA双链分子，由于RNA酶可专一性地降解未杂交的单链RNA，而双链受到保护不被降解，经凝胶电泳可以确定目的RNA的长度。该方法灵敏度较Northern杂交法更高，并可进行较为准确的定量。选择适当的探针，还可进行基因转录起始位点分析及内含子（也称内元）剪切位点分析等研究。此法的灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍。④降解DNA制备物中的RNA分子。须使用无DNAsd的RNase（DNase I free RNase），市售的一般RNase A常含有DNase，可在100 retool/I Tris—CI（pH 7．5）和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加热15 min，以去除之。（二）核糖核酸酶T1核糖核酸酶T1（RNase T1）来源于米曲霉（Aspergillus orjzae），它特异地作用于鸟嘌呤3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反应条件极广，且极难失活，其催化活性类似于RNase A。在RNA酶保护实验中，RNase T1与RNase A联合使用，对RNA进行定量和作图；还可用于去除DNA：RNA杂交体中未杂交的RNA区。（三）核糖核酸酶H核糖核酸酶H（RNase H）最早是从小牛胸腺组织中发现的，其编码基因已被克隆到大肠杆菌中。它能特异地降解DNA：RNA杂交双链中的RNA链，产生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA或RNA。在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是与大肠杆菌DNA聚合酶工和DNA连接酶一起参加cDNA克隆中第二条I）NA互补链的合成。当用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链之后，用RNase H部分消化mRNA：DNA杂交分子中的RNA，产生的RNA片段就像冈崎片段一样，作为大肠杆菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第一链为模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA连接酶的作用下，封闭缺口形成双链cDNA。

磁珠法核酸提取试剂盒原理是通过特殊条件快速裂解样本，并利用磁珠颗粒特异性吸附核酸，经过洗涤和洗脱，达到快速分离核酸的目的。试剂盒提取效率高，性能稳定，提取纯化的核酸可用于酶切、反录、PCR、 RI-PCR、 Southern blot等各种常见下游实验。磁珠法核酸提取试剂盒目前主要被用于多种类型的生物样本中病毒核酸的提取、富集、纯化步骤，其处理后的产物用于临床体外检测使用。磁珠法提取试剂常见成分SDS（十二烷基硫酸钠)——性质:1、阴离子表面活性剂：对人体微毒；2、优异的发泡剂：广泛用于洗衣粉、牙膏、洗发水、灭火器；3、易溶于热水：当水温高于8℃（≈）时，SDS的溶解度随水温升高而急剧升高。当水温升至70℃（≈），溶解度升高不明显。SDS（十二烷基硫酸钠)——作用:它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构，使蛋白质变性。在高温下可以破坏蛋白质与核酸的结合，促进核酸释放。乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40 ）：NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱。弱阳离子螯合树脂（Chelex-100）：提取液里面bling，bling的小珠子是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。知识点：chelex-100在模板中残留过多会影响PCR扩增蛋白酶K（Protein K）：是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。DNA提取中，主要作用是酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中 。聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100——曲拉通）：曲拉通X-100是一种非离子表面活性剂，在水中不解离,在溶液中稳定性高，不易受强电解质无机盐类的影响，能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成可溶性复合物；疏水端也能与膜蛋白的疏水区结合形成复合物，溶解于溶液中。异硫氰酸胍（GITC）：强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导至细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。GITC也是经典RNA提取试剂TRIZOL的主要成分。乙二胺四乙酸（EDTA）：是一种优良的钙、镁离子螯合剂。抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）。Tris-Hcl：三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与盐酸混匀后形成的缓冲剂，为裂解液及核酸提供一个比较适宜的环境。小结：经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。

pH缓冲液是确保pH测量值精确的重要因素。标准缓冲液用于校准pH 传感器和检查其性能。pH缓冲液的缓冲能力是其重要的属性。即使将外部物质加入缓冲液中，这一属性仍可使pH缓冲液保持恒定的pH值。标准缓冲液的配制与保存：1）pH标准物质应保存在干燥的地方，如混合磷酸盐pH标准物质在空气湿度较大时就会发生潮解, 一旦出现潮解, pH 标准物质即不可使用。2）配制pH标准溶液应使用二次蒸馏水或者是去离子水。如果是用于0.1级pH计测量，则可以用普通蒸馏水。  3） 配制pH标准溶液应使用较小的烧杯来稀释，以减少沾在烧杯壁上的pH标准液。存放pH标准物质的塑料袋或其它容器，除了应倒干净以外，还应用蒸馏水多次冲洗，然后将其倒入配制的pH标准溶液中，以保证配制的pH标准溶液准确无误。  4） 配制好的标准缓冲溶液一般可保存2—3个月，如发现有浑浊、发霉或沉淀等现象时，不能继续使用。5）碱性标准溶液应装在聚乙烯瓶中密闭保存。防止二氧化碳进入标准溶液后形成碳酸，降低其pH值。pH缓冲液使用方法：1.首先取少量校正液润洗小量杯，然后加入适量校正液（液面高度没过电极的感应探头即可）。2.按照电子pH测试笔使用说明书进行校正。3.由于校正液是高精密的液体，是电子ph测试笔精确度的保障，因此用过的校正液不能再倒回瓶中，以免影响校正液精度，带入细菌等，造成校正液无法继续使用。

　　标准物质(RM)reference material(RM):是一种已经确定了具有一个或多个足够均匀的特性值的物质或材料，作为分析测量行业中的"量具"，在校准测量仪器和装置、评价测量分析方法、测量物质或材料特性值和考核分析人员的操作技术水平，以及在生产过程中产品的质量控制等领域起着不可或缺的作用。　　　　下面让我们一起来了解一下标准物质的特性及级别分别是什么吧　　　　一、特性　　　　准确性、均匀性和稳定性是标准物质量值的特性和基本要求。　　　　(1)准确性　　　　通常标准物质证书中会同时给出标准物质的标准值和计量的不确定度，不确定度的来源包括称量、仪器、均匀性、稳定性、不同实验室之间以及不同方法所产生的不确定度均需计算在内。　　　　(2)均匀性　　　　均匀性是物质的某些特性具有相同组分或相同结构的状态。计量方法的精密度即标准偏差可以用来衡量标准物质的均匀性，精密度受取样量的影响，标准物质的均匀性是对给定的取样量而言的，均匀性检验的最小取样量一般都会在标准物质证书中给出。　　　　(3)稳定性　　　　稳定性是指标准物质在环境条件和时间内，其特性值保持在规定的范围内的能力。　　　　二、级别　　　　标准物质的特性值准确度是划分级别的依据，不同级别的标准物质对其均匀性和稳定性以及用途都有不同的要求。通常把标准物质分为一级标准物质和二级标准物质。　　　　一级标准物质主要用于标定比它低一级的标准物质、校准高准确度的计量仪器、研究与评定标准方法;二级标准物质主要用于满足一些一般的检测分析需求，以及社会行业的一般要求，作为工作标准物质直接使用，用于现场方法的研究和评价，用于较低要求的日常分析测量。

　　影响质粒DNA细胞转染效率因素　　　　1、质粒大小和转染量：在一般情况下，随插入片段长度的增加转染效率降低；而转染效率在一定的范围内与质粒转染量呈正相关。　　　　2、DNA质量：高质量的DNA对于转染的效率至关重要。如果质粒不纯会显著影响转染复合物的形成，进而影响转染效率。因此，可以选择提取纯度较高的试剂盒对DNA进行提取和纯化，以得到更高质量的DNA，从而提高转染效率。　　　　3、转染试剂的选择：转染试剂将外源核酸片段导入细胞，影响内源基因表达水平。在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂，例如在绵羊成纤维细胞转染过程中FuGene HD的转染效率更高，GenEscortTM I对小鼠胶质细胞则具有更好的转染效果。总之，可以遵循高效、低毒等原则进行选择。　　　　4、质粒与转染试剂比例：在一定范围内，转染效率与质粒/转染试剂比值成正相关，但毒性也会增加。可以根据转染试剂推荐比例确定合适的合适的转染比例。　　　　5、细胞状态：维持细胞生长及健康旺盛是提高转染效率的重要条件。建议选择对数生长期的细胞为佳，此时期的细胞生长旺盛，可能得到更高的转染效率，切勿选择传代次数过多，基因型可能发生改变的细胞。　　　　6、细胞密度：细胞密度过高或过低都会影响转染效果，过高则难以转染，过低则容易导致细胞死亡，因此需要选择合适的细胞融合密度进行转染，一般来说细胞密度在60%-80%时转染较为理想，但具体密度可参考转染试剂的说明书进行操作。　　　　7、血清：血清中含有大量的蛋白质，可能会降低转染效率。一般的转染试剂会要求转染时使用无血清培养基进行转染，转染完成后更换完全培养基。但现在有些新的转染试剂血清的存在已不造成威胁，甚至还有助于提高转染效率，如阳离子聚合物等。　　　　8、抗生素：抗生素，如青霉素和链霉素，一般是作为培养基中的添加物来防止细胞污染。这些抗生素对于真核细胞没有毒性，但是转染时有些转染试剂增加了细胞的通透性使抗生素进入细胞，可能会间接导致细胞死亡，从而降低转染效率。可以根据转染试剂的要求来选择是否在培养基中添加抗生素。　　　　质粒DNA细胞转染注意事项　　　　线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。而线性化DNA转染的整合几率高。质粒太大了转染会困难一些。毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。　　　　如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。

分子大小核酸分子通常很大。实际上，DNA分子可能是已知的最大的单个生物分子。但也有比较小的核酸分子。核酸分子的大小范围从21个核苷酸（小干扰RNA）到大染色体（人类染色体是一个含有2.47亿个碱基对的单个分子）不等。化学组成核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解则产生核酸和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸。DNA和RNA含有的核糖同，DNA含有脱氧核糖，而RNA含有核糖。此外，DNA和RNA中含有的碱基也有差别：DNA和RNA都含有腺嘌呤，胞嘧啶和鸟嘌呤，但DNA中不含有尿嘧啶，只有胸腺嘧啶核酸中的糖和磷酸盐通过磷酸二酯键以交替链（糖 - 磷酸骨架）相互连接。磷酸基团所连接的碳是糖的3'-末端，与碳原子结合的碳是5'-末端，这就产生了核酸的方向性。核碱基通过N-糖苷键与糖连接。在RNA和DNA中也发现了非标准核苷，它们通常来自DNA分子内的标准核苷或初始RNA转录物的修饰。转移RNA（tRNA）分子含有特别多的修饰核苷。分子组成天然存在的DNA分子在大多数情况下是双链的，而RNA分子是单链的。然而，有许多例外。一些病毒具有由双链RNA构成的基因组，而其他病毒具有单链DNA基因组 ，并且在某些情况下，可形成具有三个或四个链的核酸结构。

1．目的学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。2．原理细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4．试剂E. coli XL1-Blue，LB培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌ddH2O5．实验准备1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基，LB培养基（灭菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌ddH2O，摇菌试管（灭菌），三角烧瓶（灭菌）。6．操作步骤（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB（不含抗菌素！）培养基。（2）从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养2~3h，测定OD600为0.375（（4）将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心 10min。（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。（8）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

Trizol试剂的主要成分是苯/酚。苯/酚的主要作用是对细胞进行裂解，从而使细胞当中的蛋白质以及核酸物质解聚而得以释放。苯/酚虽然可以有效的使蛋白质变性，但它不能完全抑制RNA酶的活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹/啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（即RNA酶）。Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品的裂解液或匀浆中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯/仿(CHCl3)后离心，样品能分成水样层和有机层。而RNA存在于水样层中。在收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀的方法来还原。在除去水样层之后，样品中的核酸和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。Trizol试剂不但可用于小量样品（组织：50-100mg；细胞：5×106），也可用于大量样品（组织≥1g或细胞≥107），对动物、植物、细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。反应迅速，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保护分析等。TRIZOL提取RNA步骤1、在提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；在EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟。3、取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟。4、按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。Ps:在收集到生物材料之后，最好马上进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

　　对于无机物溶液常用下列方法分离和提纯：　　　　1、 生成沉淀法。例如NaCl 溶液里混有少量的MgCl2 杂质，可加入过量的NaOH 溶液，使Mg2+离子转化为Mg(OH)2 沉淀（但引入新的杂质OH–），过滤除去Mg(OH)　　　　2 ，然后加入适量盐酸，调节pH为中性。　　　　3、生成气体法。例如Na2SO4溶液中混有少量Na2CO3，为了不引入新的杂质并增加SO42–，可加入适量的稀H2SO4，将CO32–转化为CO2气体而除去。　　　　4、氧化还原法。例如在FeCl3溶液里有少量FeCl2杂质，可通入适量的Cl2将FeCl2 氧化为FeCl3。若在FeCl2 溶液里含有少量FeCl3 ，可加入适量的铁粉而将其除去。　　　　5、正盐和酸式盐相互转化法。例如在Na2CO3固体中含有少量NaHCO3杂质，可将固体加热，使NaHCO3分解生成Na2CO3，而除去杂质。若在NaHCO3溶液中混有少量Na2CO3杂质，可向溶液里通入足量CO2，使Na2CO3转化为NaHCO3。　　　　6、利用物质的两性除去杂质。　　　　如在Fe2O3里混有少量的Al2O3 杂质，可利用Al2O3是两性氧化物，能与强碱溶液反应，往试样里加入足量的NaOH溶液，使其中Al2O3转化为可溶性NaAlO2 ，然后过滤，洗涤难溶物，即为纯净的Fe2O3。

　　影响凝胶过滤分离效果的因素　　　　(1)层析柱的选择　　　　层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。　　　　(2)凝胶柱的鉴定　　　　凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。　　　　(3)洗脱液的选择　　　　由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。　　　　(4)加样量　　　　关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过(Ve1－Ve2)。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。　　　　从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。　　　　(5)洗脱速度　　　　洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm/hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。

　　标准品是标记免疫分析定量的依据。标准品的正确与否直接影响样品的测定结果。如果在连续测定中，或各实验室之间使用的标准品不一致，则可影响到实验结果的可比性。为此，对标记免疫分析所使用的标准品应满足如下要求。　　　　一、标准品的要求　　　　1、化学结构：原则上标准品应与被测物具有完全相同的化学结构，包括相同的立体化学结构。但在实际工作中，用化学结构完全相同的物质作标准品是十分困难的。这是由于一方面来源有限，另一方面有些被测物本身的化学结构还不清楚，或是有明显的异型性。所以有时也用结构类似的物质作标准品。此时，应充分了解这些物质与真正标准品之间的定量关系。　　　　2、化学纯度：所有通过化学合成法制备的小分子化合物，都应是高化学纯度的纯品。对某些蛋白类物质，则可能由于纯化的方法不同而有差异。对此，在最初建立该方法时，应与国际上公认的标准参考品或高纯度的纯品进行比对。　　　　3、免疫纯度：标记免疫分析是通过比较被测物质与标准品的免疫活性实现的，故被测物质与标准品对所用抗体的免疫活性应该完全一致，即两者对所用的同一抗体有完全相同的亲和力。因此，标准品的免疫纯度比其化学纯度更重要。　　　　4、反应介质：免疫学反应受反应介质和温度等条件的影响，所以理论上要求标准品和被测物应在完全相同的介质中进行反应。如测定血清中某物质的浓度，其所用的标准品也应溶解在无被测物的零值血清中；如测定尿液中某物质的浓度，其所用的标准品也应溶解在无被测物的尿液中等。但在实际工作中这一点很难做到。因为，血清中的成分十分复杂，因而无被测物的零值血清的制备非常困难，而且个体血清中还可能存在一些干扰物质。理想的标准品应该用与被测样品相同的基质(如血清)，先将被测物质完全去除，然后再加入已知量的被测物质的纯品。　　　　5、干扰物质：标准品中不能有干扰分析的物质。在作为标准品使用前，必须对那些从机体提取到的大分子物质活性进行测定。　　　　6、标准品的批量：为保证检测的连续可比性，每批标准品应有相当大的量，以保证在较长的时间内使用。每批标准品如保存的条件适当，在相当长的时间内可保持其浓度和免疫活性的稳定。这对于生产标记免疫分析试剂的厂家尤为重要。　　　　二、标准品的分级　　　　所谓标准品在英语中有三个名词，即标准品 (standard)、校准品(calibrator)和参考品(reference)。这三个名词的意义不完全相同，但在国内它们则经常被混淆。目前在我国的标记免疫分析实践中，所谓的"标准品"实际上是指校准品。为使用方便先仍用"标准品一词"。　　　　有关标准品可分为如下的等级：　　　　【国际参考品(international reference)】：国际参考品是由WHO指定的实验室制备，并与有关国家的一定机构联系(在我国是卫生部药品与生物制品检定所)，被国际公认为最高级别的标准品。到目前为止，与标记免疫分析有关的已达数十种。但由于标记免疫分析方法的迅速发展，很多标记免疫分析方法还没有国际参考品。　　　　【国家级标准品】：国家级标准品是由国家的有关权威机构，用高化学纯和高免疫纯、低交叉反应的纯品制备的，供国家内部使用。国家级标准品应与国际参考品或其他国家的国家级标准品进行比对。我国现已有国家级标准品数种，如胰岛素(insulin)、绒毛膜促性腺素(hCG)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、肝胆酸(CG)、甲胎蛋白(AFP) 等。　　　　【实验室标准】：实验室标准是由实验室自己，或由生产厂家制备的标准品，又称二级标准品。所有的二级标准品都必须经过与国家标准品或国际参考品进行比对或校正。如没有国际参考品或国家级标准品的，也应与国际公认的生产厂家的标准品进行比对。　　　　三、标准品的制备、鉴定、与计量　　　　1、标准品的制备：标准品的制备是非常复杂的问题，也是标记免疫分析中比较难于制备的一个成分。以下讨论的是实验室标准品(或商品化试剂中标准品)的制备。　　　　（1）基质的制备：如前所述，作为标准品的介质(基质)成分应与被测样品相同。对大多数用于测定血清中某物质的标准品，应用不含被测物质的零血清制备，以求反应的介质环境相当。但有时零值血清的制备十分困难，所以有些标准品用适当的缓冲液制备，并在缓冲液中加入一定量的载体蛋白(一般用1%～2%的牛血清白蛋白)，以便使其与样品的介质环境相近。　　　　零值血清的制备方法有：　　　　A、吸附法：血清中小分子物质如三碘甲状腺原氨酸 (T3)、甲状腺素(T4)等，可用活性炭吸附去除。这种方法简便，但待测物质难以清除干净，而且大分子活性物质不能用此法进行制备。　　　　B、反复冻融法：对大分子活性物质可选用低值血清，经反复冻融使被测物质失活。用这种方法可使某些蛋白类激素大部分失活，但也难以得到真正的零值血清。　　　　C、亲和层析法：用特异性抗体制备亲和层析柱，用以吸附被测抗原。用这种方法可以得到高质量的零值血清，但本法比较复杂而且成本也高。　　　　（2）标准物纯品的选择：应选择高化学纯和高免疫纯的纯品作标准品。其中免疫纯尤为重要，在标准品中不应含有与被测物质有交叉反应的物质。　　　　（3）标准品的制备：先用零值血清配置高浓度的标准品，然后根据实验系统的要求，用零值血清将高值血清稀释至应有的浓度，制成符合预定要求的，由不同浓度组成的系列标准品。　　　　2、标准品的鉴定　　　　（1）免疫活性的鉴定：选用高特异性的抗血清分别作公认标准品(如WHO的国际参考品或国家标准品)的待鉴定标准品的剂量反应曲线，并观察两条曲线的平行性。如两条剂量反应曲线平行，说明两种物质对同一抗体有相同的亲和力，即二者是同质性物质。如两条剂量反应曲线不平行，说明两种物质具有异质性，因而这一待鉴定的标准品是不能使用的。　　　　（2）浓度的标定：用已鉴定过的，免疫活性合格的标准品，与公认的标准品作浓度相同的剂量反应曲线。此时，两条剂量反应曲线应该是基本重合的。如果两者平行但不重合，则取两条剂量反应曲线的50%结合处的相应剂量( ED50 )计算二者的换算系数，然后调整待鉴定标准品的浓度，直至使两条剂量反应曲线完全或基本重合为止。　　　　3、标准品的计量：许多小分子抗原或半抗原已能得到纯品或进行合成，它们对作为标准品的要求可以得到基本的满足，其计量多直接用单位体积中的重量表示，如mg / ml、ng / ml 、pg / ml等。最近WHO推荐用质量单位取代重量单位，即mol / L、mmol / L、或nmol / L等。对大分子的活性物质则比较复杂。由于得不到绝对的纯品，故很难直接用单位体积中的重量或单位体积中的质量计量。因此，常用该物质的生物活性单位表示，如IU / L、mIU / L等。　　　　四、标准品的稳定性与保存　　　　如前所述，为保证检测的连续可比性，每批标准品应有相当大的量，以保证能在较长时间内使用。因此，每批标准品应在适当的条件下保存，使其免疫活性和浓度保持稳定。　　　　1、影响标准品稳定的因素　　　　（1）基质中的酶、细菌污染、pH的变化、氧化、潮湿等因素都可以导致标准品的变性，而且这些变化可因高温和光照加速。　　　　（2）在保存过程中发生聚合反应等分子结构的变化，可使标准品失活。　　　　（3）容器内壁的吸附作用和溶剂的蒸发可造成标准品浓度的改变。　　　　（4）保存条件不适当也可以影响标准品的稳定性，如反复的冻融可降低标准品的免疫活性等。　　　　2、标准品的保存方法　　　　（1）冷冻干燥法：冷冻干燥对标准品的浓度和免疫活性无明显的影响，是目前最常用的保存方法。冷冻干燥制品在低温下，可在较长的时间内保持稳定。但应用冷冻干燥制品时，复溶体积的准确度十分重要。因此，要用经过校准的量器准确的复溶，以减少标准品的浓度误差。　　　　（2）在标准品中加一定量的防腐剂可减少细菌污染的影响。　　　　（3）密闭真空保存或充入惰性气体等方法也可以增加标准品的稳定性。 目前最常用的方法是：在标准品中加入少量的防腐剂(如0.1%叠氮钠或0.1%硫柳汞)，冷冻干燥后密封，并在低温下保存。但应注意，一旦复溶后应放低温保存，并不得反复冻溶。复溶后的标准品其有效期明显缩短，一般不超过6～8周，有些物质可能更短。

一、实验目的(1)掌握蛋白质盐析沉淀的基本原理与操作。(2)掌握蛋白质透析分离的基本操作。二、实验原理蛋白质是亲水胶体，借助水化膜和同性电荷(在pH7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷)相互排斥作用维持蛋白质胶体的稳定，向蛋白质溶液中加入中性盐可破坏这些稳定因素，使蛋白质沉淀析出，称为盐析。盐析所得到的蛋白质沉淀经透析或用水稀释以减低或除去盐后，蛋白质能再次溶解并恢复其天然结构和生物活性，称为透析。由于蛋白质分子量很大，其颗粒直径范围在1～100nm内，不能透过半透膜。选用合适孔径的半透膜可使小分子物质透过，而蛋白质不能透过半透膜，从而可以除去与蛋白质混合的中性盐及其他小分子物质。蛋白质盐析常用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、NaCl等。蛋白质经盐析沉淀后，需脱盐才能获得纯品。脱盐最常用的方法为透析法。由于蛋白质分子量较大，不能透过半透膜，而无机盐及其他低分子物质可以透过，故利用透析法可将盐析得到的蛋白质进行纯化。将蛋白质溶液装入透析袋内，袋口用线扎紧，然后将其放进蒸馏水中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被截留在袋内，而小分子盐由于透析袋内外浓度差，可透过透析袋，通过不断更换袋外蒸馏水，直至袋内盐分透析完为止。透析常需较长时间，为保证蛋白质不变性，透析宜在低温下进行。三、实验材料与试剂1.实验材料10%鸡蛋清溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液。2.主要实验试剂饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌溶解，室温放置过夜，杯底析出白色晶体，上清液即为饱和硫酸铵溶液。硫酸铵晶体、1%硝酸银溶液等。四、实验步骤1.透析袋的预处理为防干裂，新透析袋出厂时常用10%甘油进行处理，并含少量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，需除去。将透析袋剪成100～120mm的小段，用50%乙醇煮沸1h，再依次用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗3～5次(新透析袋如不作上述特殊处理，也可用沸水煮5～10min，再用蒸馏水洗净即可使用)。透析袋一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可用特殊的透析袋夹夹紧，从另一端灌满水，用手指稍加压，检查是否有渗漏，没有渗漏后方可使用。处理好的透析袋保存于蒸馏水中待用。2.蛋白质盐析取10%鸡蛋清溶液5mL于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋清蛋白质即可析出。如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出。取少量沉淀的蛋白质，加水稀释，观察沉淀是否会再次溶解。3.蛋白质的透析注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白质溶液5mL于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，并悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，开口端位于液面之上。10min后，自烧杯中取出1mL溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，则证明蒸馏水中有Cl-存在。再自烧杯中取出1mL溶液置于另一试管中，加入1mL10%氢氧化钠溶液，然后滴加1～2滴1%硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。每隔20min更换蒸馏水一次，数小时后可观察到透析袋内出现轻微混浊，此为蛋白质沉淀。继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。实验记录透析完成所需的时间。五、注意事项蛋白质溶液用透析除盐时，正负离子透过半透膜的速度不相同，如(NH4)2SO4中的透析速度快，而透析过程中膜内的会生成H2SO4，使膜内蛋白质溶液呈酸性。因此，为避免蛋白质变性，用盐析法纯化蛋白质时，开始时应用0.1mol/L的NH4OH透析。此外，为了保证蛋白质在透析过程中不发生变性，可以将透析过程置于低温下进行。

　　RNA和DNA提取：　　　　裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 还是 RNA 而异，但共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。　　　　Chaotropes（离液剂）的作用：Chaotrope会破坏氢键及疏水间的相互作用。离液盐包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。　　　　洗涤剂：除了离液剂外，裂解缓冲液中通常还有一些去污剂，以帮助蛋白质溶解和裂解。　　　　溶菌酶和蛋白酶K:根据样品类型，也可以使用酶进行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，实际上在这些变性缓冲液中效果较好；当蛋白质变性增多，蛋白酶 K 的作用也会相应增强。然而，溶菌酶在变性中不起作用，因此溶菌酶处理通常在添加变性盐之前进行。　　　　RNA和DNA提取实验中的问题　　　　1.产量低　　　　如果您遇到的 DNA/RNA 产量低于您对样品的预期，则需要考虑许多因素。通常，这是一个裂解问题。不完全裂解是产量低的主要原因。它也可能是由不正确的绑定条件引起的。确保使用新鲜的优质乙醇（100% 200 标准）稀释缓冲液或添加到结合的步骤。劣质乙醇或旧库存可能已经吸收了水分，并且浓度不正确。如果洗涤缓冲液制备不正确，您可能正在洗掉提取的 DNA 或 RNA。　　　　2.低纯度　　　　如果提取的 DNA 被蛋白质污染（低 260/280），那么您可能开始时样品过多，而蛋白质没有完全去除或溶解。　　　　如果 DNA 的 260/230 比率不佳，则问题通常是结合或洗涤缓冲液中的盐分。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液，如果问题仍然存在，请再次洗涤色谱柱。　　　　与其他样品相比，一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题，因为腐殖质在提取过程中会被溶解。　　　　腐殖质的行为与 DNA 相似，很难从硅胶柱中去除。　　　　3.降解　　　　降解问题是RNA制备中常常到的问题。因为在 RNA 提取过程中，样品储存不当或裂解效率低等情况都会导致降解。对于 DNA 提取，降解不是一个大问题，因为对于 PCR，DNA 可以被剪切并且工作正常，如果不希望有较多剪切的 DNA，可以使用弱裂解的方法。　　　　PCR 清理时的注意事项　　　　PCR 净化其实并不是 DNA 提取技术本身，但它是一种效率高且简单的技术，它只是添加高浓度的结合盐（通常每体积 PCR 反应 3-5 体积盐）和离心来过滤。　　　　在实验过程中，PCR Clean-up 试剂盒出现故障也会导致整个实验功亏一篑。　　　　因为在PCR 反应中有较多吸收 260 度紫外线的物质，比如：核苷酸、去污剂、盐和引物。所以，PCR 净化试剂盒经常无法正常工作可能是由于 PCR 反应失败所造一般成较难清理。

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PCR反应体系中,各试剂加样量是如何确定的，DNA模板怎么提取，PCR体系。这个小小管子里都有什么东西、需要加多少呢？今天一起来看一下关于PCR体系的加样各种问题。关于体系PCR技术问世于上世纪80年代。问世之初的PCR体系比较大，动辄以毫升计。现在的PCR体系要精巧多了，总体积可大可小。我们常接触到的常规PCR以及荧光定量PCR的体系一般都在几十微升，小到可以10微升左右。早期的PCR体系，里面的组分都是各自独立加样的，包括DNA模板、上游引物、下游引物、dNTP、Buffer、MgCl2、聚合酶、水。所以早年间做一管PCR需要加样7——8次才能加完一管。现在就简化多了。除了特异的 DNA模板与引物以外，其他几种成分可以做到混在一起，做为PCR Mix统一加样。这样每个管一般只需做4次加样操作即可完成，工作量减少近一半。DNA模板来源DNA模板一般来自于从组织中提取的DNA、或者从RNA逆转录得到的cDNA。很多经验表明，逆转录得到的cDNA一般要稀释10倍再做荧光定量PCR，这样得到的CT值会在一个比较理想的范围内。当然这并不是固定的做法，还要根据你的实际情况来做调整。用于PCR的引物浓度，比较常用的是10 p mol/ul、等于10 uM。注意单位哦。PCR mixPCR Mix由于已经是现成的，所以你不必调节里面的组分。放心，组分肯定是够用的。因为在一个PCR体系内，引物和dNTP、酶等都是足量甚至过量的。当然PCR Mix并不是简单的把那几种成分一古脑混在一起就行的，里面还需要特殊成分以维持其稳定性。对于荧光定量PCR用的Mix，里面还会预混有荧光染料。dna如果你对DNA聚合酶有特殊要求，不想简单的采用PCR Mix，那么你可以单独选择你要的那种酶，以及相应的其他组分相配合。关于体系中的水水是用于补齐总体积的。PCR由于成分多、各成分又有不同体积，所以加起来的总体积可能并不刚好是理论上的总体积。计算总体积一般要参考其中的Buffer的体积。如果是10 x Buffer，那么总体积就应该是10 x Buffer体积的10倍。如果达不到这么多，就加水补齐。如果PCR Mix以及模板和引物的总体积是刚好的，就可不必加水了。早年的PCR体系往往还要加另一种成分：液体石蜡油。在PCR总体系配制完成后，最后再在上面加一层液体石蜡油。液体石蜡油比较轻，会漂浮在上面，可防止体系中的水分挥发。这是一种简单但很实用的做法。现在的PCR管密封很好，又有完善的热盖系统，所以这种做法现在已经不太常见了。

试剂的验收一般有两种：一种是符合性验收，购置的试剂与计划是否相符，比如石油醚有沸程30-60℃，也有60-90℃。一种就是技术验证，重要的对实验有影响的需做技术验证，比如色谱用氮气，纯度不够的话可能影响实验的进行，就需要做技术性验证，或者试用合格不合格。在检测过程中试剂对检测结果的质量保证不可忽视，因此试剂管理非常重要。附上试剂管理方法，希望对大家有所帮助。实验室试剂管理一、试剂的采购试剂管理员根据检验项目、工作量和工作进度的需求，填写采购申请，经技术负责人审核，实验室主任（或其他相关人，实验室自己根据情况确定）批准后交采购部门进行采购，采购需从《合格供应商名录》中合格供应商处采购。注：1、采购申请中需包含试剂名称、规格型号（500mL/瓶、4 mL/瓶等）、试剂的级别（色谱纯、优级纯、分析纯等）、数量等。2、《合格供应商名录》需要定期评审，不合格的供应商及时剔除。二、试剂的验收试剂到货后，技术负责人负责组织检测室人员根据其性质和试验类型对试剂的标签、证书或其它证明文件的信息进行检查，对可用性进行评估、审查试剂是否符合相应标准、规范的要求，是否能满足检测工作的需要。具体验收方法按照各个实验室自己制定的《试剂验收方法》，填写验收记录。注：1.实验室需编制具体的试剂验收方法作业指导书。2.验收记录必须有试剂的技术性验收资料，如：石油醚实测的沸程，进行空白验收等判断试剂在试验中使用是否对结果造成影响。三、试剂的储存试剂验收合格后入库由试剂管理员统一管理，填写《试剂台账》。试剂管理员根据试剂的特点（考虑试剂毒性、对热、空气和光的稳定性等等）配置相应的贮存设施进行储存。试剂管理员根据《设施和环境管理程序》对保存环境进行监测，以保证培养基和试剂不变质、不损坏、不降低性能。注：1.试剂台账主要内容包括：试剂名称、规格型号、生产批号、有效期 、生产厂家、入库数量、出库数量、库存等。2.存储设施加贴标识：易燃、腐蚀、剧毒等。四、试剂的使用检测人员在使用新开封试剂时，应对其质量进行检查。任何物理性状明显改变、出现沉淀、变色等的试剂不得使用。检测人员严格按照检测方法要求使用或配制试剂，试剂配制时及时填写《试剂配制记录》，试剂配制人员要有签名,并填写“试剂标识”加贴在装试剂的容器上。质量监督员对试剂的使用过程进行监督检查，保证检测人员正确使用试剂。五、使用后的试剂的弃置使用后的试剂，严格按照《实验室废弃物管理规定》执行，确保弃置试剂的安全性，不污染环境。

　　培养基的配制原理　　　　按照微生物生长的营养需求及其相互比例配制的。　　　　一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）、维生素和水等几大类物质，培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境，培养基种类很多。　　　　根据配制原料的来源可分为自然培养基、合成培养基、半合成培养基；根据物理状态可分为固体培养基、液体培养基、半固体培养基；根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等。　　　　配制培养基的步骤　　　　1、配制溶液　　　　向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。　　　　配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。　　　　2、调节pH值　　　　用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。　　　　3、过滤　　　　用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。　　　　4、分装　　　　已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。　　　　分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。　　　　装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。　　　　5、加棉塞　　　　分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。　　　　制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。　　　　棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。　　　　6、制作斜面培养基和平板培养基　　　　培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。　　　　(1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。　　　　(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。　　　　铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基未长杂菌，即可用来培养微生物。

　　琼脂糖凝胶电泳检测DNA原理　　　　琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，其特点为简便、快速。　　　　DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。　　　　对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。　　　　琼脂糖凝胶电泳的适用范围　　　　琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。　　　　（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）　　　　琼脂糖凝胶电泳实验需注意以下几点：　　　　1.体系配制时候最关键的几个试剂一定要确定它们还有效、或者还没被污染：引物，酶，超纯水。这些东西最好自己收好，写上个人的名字放好，冰盒上记得带上橡皮筋，这样就不会因为别人翻冰箱时候把你的冰盒碰散了，试剂都碰掉。否则，你的试剂被污染了，到时候阴性对照狂出条带，再去找污染源很麻烦。而且配置体系时候要注意保持实验区的干净，事先可用小喷壶进行酒精喷雾，固定空气中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染体系。　　　　2.pcr体系要摸准，最好用人家都做得很多的老体系来上手。　　　　3.要想得到漂亮的电泳图，可以在PCR开始时候就把胶倒上（前提是你的PCR总时间在1.5小时左右，并且1.5小时候之后你还在实验室。），让凝胶凉着，这样凝胶的上样孔会比较规则，胶体里面的其本身的孔径也会较规则。如果你要第二天再跑胶，千万记得把PCR完毕的样本放入4℃保存。第二天做时候建议把胶凉上25分钟左右。　　　　4.琼脂糖凝胶电泳上样时候建议使用排枪上样，不仅快速而且样本加到胶孔里的速度一致。当然，排枪上样最好选用进口枪头。　　　　5.不管电泳室使用的频率高还是低，我都建议每次琼脂糖凝胶电泳时候更换电泳液，避免出现“＾”形条带。

多重qPCR探针的荧光基团的基本要求1. 避免荧光基团相互干扰多重qPCR的实验设计要求比单一反应体系的要复杂的多。检测不同指标的探针必须携带不同光谱范围的荧光基团。很多荧光光谱相近的荧光基团，它们虽然最大发射波长不同，但是在附近的波段内还是会有相互重叠的，一定要避免荧光基团发射光谱之间的相互干扰。2. 根据荧光强度分配检测指标不同荧光基团的荧光强度是有高有低的，例如FAM就是一个荧光强度相对较高的基团，我们偏向于将其安排给相对表达量比较低的目的基因，而荧光强度相对较低的基团可以用于检测表达量比较高的如看家基因等，这样会达到扩增曲线平台期接近的目的，结果会比较美观。3. 按照荧光定量PCR仪来选择荧光基团不同荧光定量PCR仪的激发光和发射光都是不相同的，因此需要根据对应的仪器选择适配的荧光基团。目前最广泛通用的荧光基团为FAM（FITC），因此，绝大多数多重qPCR策略首选的一个通道为FAM。如果使用仪器不适配的荧光基团，则在此之前必须对仪器针对这种荧光基团进行矫正。目前，主流的荧光定量PCR仪还是能够支持较多通道的多重检测的。4. 搭配淬灭基团的选择在选完探针的荧光基团之后，根据荧光基团的种类搭配淬灭基团即可，多重qPCR并不要求淬灭基团的不同，例如两重qPCR分别选择了FAM及VIC作为荧光基团，淬灭基团可以统一选择BHQ-1。多重qPCR还需要优化引物探针序列的特异性，防止其相互产生干扰；确定最佳的引物-探针比值等等工作。正常情况极限不超过4重，超过4重的会比较困难。

　　rtpcr和实时荧光定量pcr区别如下：　　　　1、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。　　　　2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。　　　　基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。　　　　3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。　　　　至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。　　　　例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。