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怎样从总rna中进行mrna的分离和纯化
目前常用的mRNA的纯化方法有: (1)寡聚(dT)-纤维素柱层析法,即分离mRNA的标准方法; (2)寡聚(dT)-纤维素液相离心法,即用寡聚(dT)-纤维素直接加入到总的 RNA溶液中并使mRNA与寡聚(dT)-纤维素结合,离心收集寡聚(dT)-纤维素/mRNA复合物,再用洗脱液分离mRNA,然后离心除去寡聚(dT)-纤维素; (3)其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。 本实验应用方法(1)进行mRNA的分离纯化。 【试剂与器材】 (一)试剂 1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL 2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素 3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL 或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。 4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。 配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。 5. 5 mol/L NaCl,每组10mL 6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL 7. 无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL 8. 70%乙醇,每组10mL 注意:溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最hao能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。
生物产业
2019/05/24
质粒DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测
实验方法原理: 1、碱变性法提取质粒DNA:细菌培养物加入SDS和NaOH碱性溶液处理后,菌体裂解,可使细菌的质粒DNA、染色体DNA和RNA一起从细胞内释放出来,经琼脂糖凝胶电泳,因各种核酸分子的迁移率不同将上述核酸分成不同的带。用溴化乙锭(EB)染色后,在紫外线灯下可看到各种核酸带发出的荧光。根据荧光的位置,可区分不同的核酸带。 2、琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶电泳技术(Agarosegelelectroghoresis)是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度,并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1——6.0kb的双链DNA片段。琼脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应,此外,在弱碱性条件下,DNA分子带负电荷,从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同,它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭(EB)能与双链DNA结合的作用,利用EB染色,并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。
生物产业
2019/05/21
重组质粒的转化、筛选和鉴定操作
二、实验原理: 重组子的建立:采用双酶切 质粒 载体pBR322和pUC18,酶切后产生了互补的粘性末端,在T4 DNA 连接酶的作用下,两个质粒片段连接. 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一些特殊方法(如:CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) . 转化(transformation):是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术. 电转化法:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞. 克隆的筛选:主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有:氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等; 重组质粒克隆的鉴定:鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法. 最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选.
生物产业
2019/03/12
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CGS缓冲液(pH6.5)配制方法
产品名称:CGS缓冲液(pH6.5) 规格:500ml/瓶 产品分类:其他 储存条件:4℃,3个月 主要组成:由柠檬酸钠、葡萄糖、氯化钠等组成。 主要用途:含葡萄糖等营养成分,应注意避免污染 CGS缓冲液(pH6.5)常用于血小板的制备。主要成分为NaCl,Glucose等。
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2020/05/06
巴比妥钠缓冲液(pH7.4)
操作步骤(仅供参考):? 1、绵羊红细胞的制备? ⑴?取绵羊颈静脉血,立即加入等量的抗凝剂,充分混匀。? ⑵?加入适量的1×巴比妥缓冲液,离心,弃上清。? ⑶?重复步骤(2)2次,以便清洗干净。 ⑷?取2ml上述绵羊红细胞溶液,加入98ml?1×巴比妥缓冲液,配制成2%的绵羊红细胞悬液。? ⑸?为了使2%的绵羊红细胞悬液标准化,一般吸取0.2ml?2%的绵羊红细胞悬液加入1×巴比妥缓冲液。 2、?致敏绵羊红细胞的制备? ⑴?用1×巴比妥缓冲液将已知效价的溶血素稀释至2单位。? ⑵?取上述2单位的溶血素、2%的绵羊红细胞悬液等量混合。? ⑶?孵育,并每隔几分钟振摇一次,使绵羊红细胞致敏。 注意事项:? 1、制备细胞悬液时应根据实验具体需要操作。? 2、离心步骤尽量在4℃离心机上操作。 3、稀释成1×巴比妥缓冲液,应尽量在24h内使用。? 4、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
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2019/03/12
上海远慕生物科技有限公司
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