准备好物品,超净台消毒好。培养基等到位。小鼠颈椎脱臼处死,放入酒精浸泡5min。倒掉酒精,超净台中无菌取小鼠股骨和胫骨,置入成有1640培养基的培养皿 中。注意不要沾到小鼠毛发而污染。骨头上肉不需要剔得太干净,两端骨骺端尽量减掉,方便针头插入。在一只培养 皿中浸泡一遍,转入第二只培养基。除去可能的污染毛发。
在第二只培养基中用1ml针头反复冲洗骨髓腔,直至骨头变白。将获得的骨髓细胞收集于离心管,1000转,5min,离心。弃上清。加入2ml Tris NH4CL裂红,震荡混匀,静置1min。加入15ml 1640终止反应,离心,弃上清。离心时配置培养基:50ml离心管,45ml 1640,5ml 胎牛血清,GM-CSF终浓度10ng/ml, IL-4终浓度1ng/ml。
在弃上清后的离心管中加入25ml配置的培养基,混匀,接种于6孔板,4ml/孔,于37℃,5%CO2培养。3d后可见板底贴壁集落,培养基变黄。更换培养基。
5d后可以用LPS进行刺激,d6测表型。d7测细胞因子。流式细胞仪计数,可培养10e7细胞数。
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