按照现行的国标方法,金黄色葡萄球菌检测方法分为第一法定性检验、第二法平板计数法(适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品),以及第三法MPN计数法(适用于金黄色葡萄球菌含量较低的食品)。
第一法/定性法
选择性分离划线
1)这一步是整个金黄色葡萄球菌检测环节最重要的步骤,因为平板划线分离的效果决定了可疑菌落的判定和选择。
2)平板划线选择四分法
3)一般习惯选用的分离培养基为Baird-Parker平板 (BP) 和血平板。常见金黄色葡萄球菌在BP上的可疑菌落呈圆形,较小(2-3 mm),凸起,颜色呈灰黑色至黑色 (黑色居多) ,最主要的现象是菌落周围有透明环出现。
该平板在含有氮源的基础上,补充了促进细菌生长的丙酮酸钠,又含有抑制剂亚碲酸钾,故有较好的选择性。
但对于金葡萄球菌没有抑制,其能将亚碲酸钾还原为碲在菌落中心呈黑色,易于观察;加入卵黄,由于卵磷酯酶阳性特征,其菌落周围可出现一明显的沉淀环。
在血平板上菌落较大,圆形,光滑凸起,菌落周围可以看见完全透明溶血圈。结合两种培养基特性确定可以菌落。
血浆凝固酶试验
首先打开恒温水浴锅 (较之恒温培养箱,优点是传热快速,便于凝血观察) ,温度调至36℃±1℃。购买冻干兔血浆,按照说明加入500 L生理盐水复溶。再加入300 L BHI培养物,缓缓震荡混匀,置于水浴锅中(注意:仅需将西林瓶体浸入水体即可。)
每半小时观察一次凝集情况,连续观察6 h (根据经验,若强阳性,一般在1-2 h就会凝集了,还遇到半个小时凝集的,长的在3 h左右凝集。注意:切忌一直放那里不观察,直接放6 h去看,因为凝固后,还会发生自溶现象的,隔夜自溶是常见的。)
判断凝集的最好方法就是倒立,观察结块,效果最好的就是倒立后内容物不下落。
第二法/平板计数法
选择性平板采用BP平板,该平板可提前一天配制——洁净台中放置过夜或置于25~50℃培养基中干燥,直到平板表面的水珠消失后备用。该步骤的目的是检查平板是否染菌,最重要的是挥发培养基内部的水分以利于涂布。
每个梯度分别吸取1mL样品匀液,以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别接种至3块BP平板上,然后用无菌涂布棒涂布整个平板。如涂布棒不是一次性的,可以提前灭菌备用,也可用酒精灯灼烧2min以上冷却备用。
涂布时尽量涂干,注意不要触及平板边缘。此后将平板静置10min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱36±1℃培养1h。等样品匀液吸收后翻转平板,倒置后于36±1℃培养24~48h(倒置培养的目的在于防止与空气中的细菌交叉污染,还可防止培养基水分挥发太快),观察结果。
从上三幅图的菌落生长情况可以观察到,10-1稀释度菌落生长杂多,难以计数,最适技术范围为20-200 cfu/梯度,所以10-2稀释度满足计数要求,可疑菌总数在适宜计数范围内,10-3稀释度可疑菌落很少,舍去。
大家从10-2梯度上可以看出,具有沉淀环的菌落很多,需要从这些菌种选择5个或以上可疑菌落进行血浆凝固酶试验,但是这5个菌落该如何选择才能使最终的结果最接近真实值是需要技巧的。
首先可以观察到,平板上的可疑菌落沉淀环有两种,一种是和菌落有点距离的沉淀环 (姑且称为晕环后可知此菌为干扰菌-表皮葡萄球菌),一种是从菌落边缘直接延伸出来的沉淀环 (姑且称为晕圈)根据经验,将所有有晕环的菌落出来,也将所有有晕圈的菌落数出来,同时判断可疑菌落是两类不同的菌。根据两者菌落数的比例大小决定挑选可疑菌落数的分配情况,比例大的多选,比例小的少选,就是这样的原则。
此次该梯度可疑菌落数为45 cfu。晕环菌落数和晕圈菌落数大概比例在3:2,所以分配数也出来了。选择5个菌落在血平板上划线,同时分别接种BHI培养管,36C1C培养24 h。
典型菌落计数和确认
金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样黏稠感。
有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。
选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU~200 CFU之间的平板,计数典型菌落数。
从典型菌落中至少选5个可疑菌落(小于5个全选)进行鉴定试验。分别做染色镜检,血浆凝固酶试验:同时划线接种到血平板36℃±1℃培养 18 h~24h后观察菌落形态,金黄色葡萄球菌菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。
第三法/MPN计数
根据对样品污染状况的估计,选择3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进行10倍递增稀释的同时,每个稀释度分别接种 1 mL 样品匀液至 7.5%氯化钠肉汤管(如接种量超过1mL,则用双料7.5%氯化钠肉汤),每个稀释度接种3管,将上述接种物36℃±1℃培养18 h~24h。
用接种环从培养后的7.5氯化钠肉汤管中分别取培养物1环,移种于Baird-Parker 平板36℃±1℃培养,24h~48 h。
更多
新冠病毒核酸检测假阴性/假阳性问题探索及解决方案
新品
2020.02.21
"十四五"时期产业升级背景下助力氟硅行业安全生产及过程监控
厂商
2022.06.22
河南省中药开发工程技术研究中心与东京理化器械株式会社共建中药化学实验室续签及揭牌仪式隆重举行
厂商
2023.12.12
石棉纤维拉曼分析
厂商
2024.08.01