MEG-01?

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细胞的冻存

【概述】

冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能力代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。

在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。目前多采用甘油或者二甲基亚砜作为保护剂。这两种物质在深低温冷冻后对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透

性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。

【用品】

胰酶、含血清培养基、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（667.83kPa蒸汽高压消毒）、吸管、离心管、冻存管

【步骤】

[1] 用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基；

[2] 加入少量PBS冲洗二遍， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，依据传代的方法把细胞 悬液收集于离心管中，离心1000 rpm，5-8 min；

[3] 小心弃上清液，加入配置好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后将含有细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管加液1-1.5 ml，细胞最终密度为（5—10）×106/ml；

[4] 冻存管封口，做好标记，按照以下程序冻存：4℃，15min--20 min,﹣20℃ 30min--40 min，见细胞悬液结冻后，放入﹣80 ℃冰箱3h或过夜，之后置于液氮中。

【注意事项】

[1] 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好选择对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率很低。在冻存前一天最好换1次培养液。

[2] 将标记好并装入冻存管的支架，从液氮容器口缓缓放入，按1℃/ min的降温速度，在30-40min时间内使其到达液氮表面。再停30min后，直接投入液氮中。

[3] 细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。
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