PI、7-AAD和DAPI的区别

联科生物

2015/05/18 22:39

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PI 7-AAD DAPI 英文全称 Propidium iodide 碘化丙啶 7-amino-actinomycin D 7氨基放线菌素 4',6-diamidino-2-phenylindole 4，6-联脒-2-苯基吲哚染色原理荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。 7-AAD 是一种核酸染料，它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。 DAPI可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。膜通透性否否能染色位置细胞核细胞核细胞核灵敏度中中高检测通道使用488 nm激发，用610/20 BP收集， FL-2检测通道用488nm激发，用670/14BP收集，FL-3检测通道用355nm激发，用440/40BP收集；也可用405nm激发，450/50BP收集能否检测早期细胞凋亡能能不能缺点不能区别晚期凋亡和坏死细胞不能区别晚期凋亡和坏死细胞强烈致癌使用方法（1)、用合适的方法诱导细胞凋亡； (2)、悬浮细胞离心（1500rpm 离心 5min）收集；贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培养基洗一次（注：胰酶消化时间不易过长，否则容易引起假阳性）；或直接用Accutase酶消化（无需终止）；1500rpm 离心 5min收集细胞； (3)、用PBS洗涤细胞两次（1500rpm离心5min）收集1-5 X105细胞，弃上清； (4)、制备1X Binding Buffer缓冲液：按10次分析的量计算，加1ml 5X Binding Buffer缓冲液到4ml的去离子水； (5)、用500ul 1X Binding Buffer重悬细胞(第4步稀释的缓冲液） (6)、加入5ul annexin-V FITC和10ul PI (7)、避光室温孵育5分钟 (8)、上机检测 1.通过合适的方法来诱导细胞凋亡； 2.清洗两次细胞；在第二次清洗后，去除细胞颗粒残留的PBS。 3.在冷的1X结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到1 x 106 到1 x 107 cells/mL。 4.添加100ul细胞（106个）悬液到每管。 5.添加5 μl ofAnnexin V-PE 和 10μl的 7-AAD. 6.温柔混匀，冰上孵育15分钟。 7.不用清洗，添加1X结合缓冲液到每管。 8.流式数据分析。 1.稀释DAPI储存液到3 微摩染液（100mM Tris,PH7.4,150Mm,NaCl,1mMCaCl2,0.5mM MgCl2,0.1%Nonidet P-40），每个细胞样品中需要1 ML。 2.在室温下，轻轻弹管使得细胞颗粒分散，添加5mL的PBS，让细胞水化15分钟。 3.离心上述的悬浮细胞，弃悬浮液。轻轻弹管使细胞分散，添加1ML的被染液稀释的DAPI容液。 4.流式分析染料的存在。如果细胞在绿色荧光显微镜下能够看到，离心样本，去除上清，在新鲜的缓冲溶液中重悬。 5.提供一滴到显微载玻片上，用盖玻片盖住，观察。