关于ELISA样本值低于空白值的问题

联科生物

2015/01/29 16:54

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在ELISA实验中，样本值低于空白值是一个经常性的问题。当样本值较低接近试剂盒的灵敏度就容易发生样本值低于空白值的现象，特别是在血清和血浆样本的检测。究其原因，主要在于两个方面，一方面是误差，另一方面是基质效应。下文逐个分析不同影响因素的原理、和解决方案。一、误差 Error 误差分为三类，系统误差、随机误差和过失误差。这三类误差中，系统误差对样本值和空白值之间的差异无影响。ELISA样本值低于空白值在误差方面主要来源于随机误差和过失误差。
1、随机误差 Random Error 无法控制的变因，使测量值产生随机分布的误差，服从统计学上的正态分布。从统计学上来看，测量值有99%的置信限在±3SD之间，如果CV值是20%，随机误差的边界就是±60%，也就是说在CV值20%的状况下，样本值低于空白值60%之内，有可能是随机误差的影响，特别是空白值只有一个值时。随机误差不可消除，只能通过多次测量获得的均值尽量逼近真值。降低随机误差的解决方案1是增加空白值的重复数量，一般认为空白值重复10次，测量均值接近真值。方案2是提高实验技能，也能够有效降低随机误差的影响。如果CV值在5%，样本值趋近于零时，在统计上样本值将不会低于空白值15%。 2、过失误差 Gross Error 过失误差主要是由于测量者的疏忽，犯了不应有的错误造成的。过失误差是可以避免的。针对于ELISA样本值低于空白值的问题，过失误差产生的原因多数来源于空白孔HRP的重复加样或污染或洗涤不干净，造成空白值偏高，相对比来说，样本值低于空白值。解决方案就是重复实验，规范操作。
二、基质效应 Matrix Effect 分析中，基质指的是样本中被分析物之外的组分，基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。ELISA试剂盒在开发过程中，标准品不能采用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液，只能采用其模拟物。模拟物与被测样本在蛋白丰度、复杂性、pH等因素都会存在差异。当样本的基质与其模拟物相比，降低抗原抗体的结合，便产生了样本值低于空白值的现象。造成样本值无法计算出数值，或者数值为负。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样本中的基质不变，建立一个校正曲线（Calibration Curve）。当单个样本或少量样本值低于空白值时，可能是误差原因，这时应增加重复，提高操作技能。当大量样本都低于空白值时，应考虑基质效应的影响，建立校正曲线予以修正。