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质粒抽提过程中有很多步骤会影响最后的产量和质量,那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢? 目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。 溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性,但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候,结果的可重复性将显著下降。而且,3.0以上的读值是无法使用的,它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此,为了获得可靠的DNA分光光度定量结果,A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时,使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。 造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节,可于每一纯化步骤都保留一小部分样品,并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。 |
制备样本 |
如各个实验方案和下列表格中所示,从澄清裂解液(样本1)、流出液(样本2)、QC洗涤缓冲液的混合组分(样本3)和QF/QN缓冲液洗脱产物(样本4)中各取出部分样品。使用1倍体积的异丙醇沉淀核酸,并使用70%的乙醇洗涤该沉淀,充分蒸干后重悬于10 μl pH8.0的TE缓冲液中。 表一 琼脂糖凝胶分析所需样本体积 样本 实验方案步骤 Midi Maxi Mega Giga (极低拷贝数质粒/科斯质粒) QIAGEN-tip 100 (极低拷贝数质粒/科斯质粒)QIAGEN-tip 500 1 240 μl 120 μl 120 μl 75 μl 600 μl 750 μl 2 240 μl 120 μl 120 μl 75 μl 50 μl 24 μl 3 400 μl 240 μl 160 μl 120 μl 200 μl 120 μl 4 100 μl 60 μl 22 μl 20 μl 50 μl 30 μl (制备产物占样本量的百分比) 2% 0.40% 0.08% 0.02% 1% 0.20% |
琼脂糖凝胶分析 |
在1%的琼脂糖凝胶*中,对于各个质粒纯化步骤中的对应样品各加入2 μl进行电泳。 以上信息来源于: |
阅读原文:http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2015010011.html
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