质粒DNA质量如何评估才可靠？

联科生物

2015/01/11 21:13

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质粒抽提过程中有很多步骤会影响最后的产量和质量，那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢？

目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。

溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性，但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候，结果的可重复性将显著下降。而且，3.0以上的读值是无法使用的，它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此，为了获得可靠的DNA分光光度定量结果，A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时，使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。

造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节，可于每一纯化步骤都保留一小部分样品，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

制备样本

如各个实验方案和下列表格中所示，从澄清裂解液（样本1）、流出液（样本2）、QC洗涤缓冲液的混合组分（样本3）和QF/QN缓冲液洗脱产物（样本4）中各取出部分样品。使用1倍体积的异丙醇沉淀核酸，并使用70%的乙醇洗涤该沉淀，充分蒸干后重悬于10 μl pH8.0的TE缓冲液中。

表一琼脂糖凝胶分析所需样本体积

样本实验方案步骤 Midi Maxi Mega Giga （极低拷贝数质粒/科斯质粒） QIAGEN-tip 100 （极低拷贝数质粒/科斯质粒）QIAGEN-tip 500 1 240 μl 120 μl 120 μl 75 μl 600 μl 750 μl 2 240 μl 120 μl 120 μl 75 μl 50 μl 24 μl 3 400 μl 240 μl 160 μl 120 μl 200 μl 120 μl 4 100 μl 60 μl 22 μl 20 μl 50 μl 30 μl (制备产物占样本量的百分比) 2% 0.40% 0.08% 0.02% 1% 0.20%

琼脂糖凝胶分析

在1%的琼脂糖凝胶*中，对于各个质粒纯化步骤中的对应样品各加入2 μl进行电泳。

以上信息来源于：

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/reliability%20of%20dna%20quantification%20by%20spectrophotometry/

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/agarose%20gel%20analysis%20of%20the%20purification%20procedure/

阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2015010011.html