:染色质免疫沉淀（ChIP）法

12:染色质免疫沉淀（ChIP）法
?细胞在室温下用 PBS 漂洗 2 次，并重悬浮至约 5x105 cells/ml（细胞总数约 2x107）。加入甲醛，至终浓度为 1% 并在室温下孵育 10 分钟 。
?加入终浓度 0.125 M 的甘氨酸以终止交联反应。
?沉淀细胞（2,000 RPM, 5 分钟）然后用冰冷的 PBS 漂洗一次。
?用 6 ml 细胞裂解液（sc-45000）轻轻搅动重悬浮细胞。
?离心 2,000 RPM， 5 分钟收集粗核提取物。
?用 PBS 再次漂洗。沉淀物可以冷冻或进行下一步操作。
a)用~1.9 ml 高盐裂解液（sc-45001）重悬浮沉淀，然后移入 2 ml 的微离心管以备超声步骤。
b)因为实验结果可能因使用不同的超声器而有差异，所以应该选择最佳的超声条件。以下状态是用 Sonics VC130 超声仪和 3 毫米探头为例。
c)冰上超声震动，强度在 5－6，持续状态，30 秒 x 4 次。
d)提取物在 4° C 离心 10,000 rpm，15 分钟。保留上清（染色质）。
e)上清液的蛋白浓度测定。
f)For the IP step we recommend using 100-500 μg supernatant and 0.1-1 μl TransCruz reagent (0.2-2 μg).
当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色
    ① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
    ② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
    ③ 对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
    ④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
    ⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
    ⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
    ⑦ 检查色原/底物溶液，最简单的检测方法是将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变化，则可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后应在一定时间内用完，否则会失效。
    ⑧ 检查冲洗液是否和反应试剂匹配，溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。
    ⑨ 检查复染剂和封片剂是否和所使用的色原匹配。