ChIP 利器 Bioruptor

                           ChIP实验的三大基石

表观遗传学目前是个热门领域，染色质免疫共沉淀（ChIP）是表观遗传学研究中最常用的研究手段。  

ChIP通过针对染色质相关蛋白（组蛋白、转录因子等）的抗体，来鉴定与该蛋白（或蛋白修饰）相连的序列。这种方式能够帮助人们定位基因组中发生的表观遗传学改变。举例来说，针对H3K4me3（赖氨酸-4上的组蛋白H3三甲基化）的抗体可用来检测活跃表达的基因，而针对H3K27me3的抗体可用于检测沉默的基因。

类似的技术还包括RIP（RNA免疫沉淀）和MeDIP（甲基化DNA免疫沉淀）。RIP可以帮助人们鉴定与特定RNA结合蛋白相连的RNA；而MeDIP技术允许研究者pull down甲基化的染色质序列。

一、提高染色质的质量

与绝大多数实验方法相同，ChIP也遵循着GIGO原则（Garbage in, garbage out）。如果你的染色质原材料不佳，当然就很难得到理想的实验结果。同时如果你的原材料OK,下一步片段化处理没有做好，任然是徒劳。

目前人们一般通过超声或者酶切将染色质片段成几百Bp，但普通超声破碎仪很难拿捏。超声时间过长或力度过强都会令蛋白变性，使其与核酸分离或者破坏抗体识别的抗原表位。这种方案需要进行大量的优化，过多的参数（比如需要考虑的关键参数：超声力度、超声时间和超声衰减）往往令人难以达成一个稳定的实验体系。

幸亏目前有一款超声破碎仪，那就是Diagenode公司生产的Bioruptor 水槽式非接触式超声破碎仪，他一次最多可以处理12个样品，同时Bioruptor 超声破碎仪厂商建议无论每次处理几个样品都把空余的样品管孔用空白对照样品管补齐，保证每次超声能量相同，便于建立稳定的实验体系，这样子每次每个样品的能量分布都相同的，把复杂的多参数设置简化为仅以超声时间作为单一设置参数，解决了繁杂的参数误差，做到准确高重复性，快速获得稳定的实验体系，从而获得更加准确的实验数据，很多科研人员称Bioruptor为ChIP实验的神器、金标准，可谓名副其实。

另外有些科研人员喜欢用酶切的方法，酶切的方法其实可以加入超声步骤，超声有助于从细胞核释放更多的染色质。不过为了简单直接，单纯的酶切处理更为普遍。 要说明的是，酶学片段化方案也存在着一定的弊端，因为核酸酶有时会表现出序列偏好，从而影响结果的真实性。另外，酶学消化也并不总能与甲醛交联（ChIP的一个关键步骤）兼容。

二、保证抗体的质量  

用来进行pull-down的抗体，是成功ChIP的另一个关键因素。与Western blot相比核酸IP对抗体的要求更多。举例来说，Western blot抗体识别的是变性蛋白。但在ChIP应用中，你需要确保抗体识别蛋白的三级结构或者一个暴露的抗原表位。

最好的办法是选择一款经ChIP（或RIP或MeDIP）验证的抗体。例如，Diagenode公司提供一系列已验证的抗体。该公司致力于表观遗传学研究的服务领域，生产高品质的抗体，同时也为ChIP实验设计了Bioruptor系列超声剪切产品。确保使用高质量的抗体，是ChIP实验成功的关键，不可迁就，舍本求末。

三、控制细胞数

ChIP一般使用体外培养的细胞，每次反应所需的细胞量因地制宜。现在，人们常常需要研究更为特殊的样本，例如肿瘤、组织活检样本、干细胞、已存档的FFPE样本（甲醛固定石蜡包埋）、流式细胞分选或激光捕获显微切割所富集的细胞。在这些情况下实验所需的细胞量取决于研究的对象，组蛋白修饰比较丰富，需要的样本量也就相对较少。而转录因子丰度较低，一般需要大约一百万细胞，不过如果信噪比高，那么样本量也可以适当减少。针对于珍贵的微量样品， Bioruptor超声破碎仪最新型号PICO可以处理低至5ul的样品，同时由于是非接触式超声，不存在污染及损耗，保证了实验材料的质量；对于样品量比较大的样品可以使用Bioruptor PLUS这款更通用性的Bioruptor超声破碎仪，可以处理20ml-50ul的体系。利用Bioruptor超声破碎仪可以根据不同的实验要求优化合理的ChIP体系，稳定的ChIP体系在完美重复性的ChIP神器帮助下可谓事半功倍。