交联葡聚糖微球Cross Link Dextran
使用方法
1. 乙醇浸泡:
在室温下,将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时,并不断搅拌以保证凝胶溶胀,用无盐水洗去残存的乙醇滤干;
2.无盐水浸泡:
室温下,在无盐水中充分溶胀24小时,间隙搅拌,以保证凝胶的完全溶胀,然后;
3. 盐酸浸泡:
在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时,间隙搅拌,滤干,水洗至中性;
4. 将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内,注意保持湿态装柱,并避免柱内产生气泡或断层;
5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值);
6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积,我们建议初次上样控制在1-2%的床体积,视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积,柱高的选择也与分离要求相关,柱高控制在40-50cm 以下,过高的凝胶层会引起较大的反压,应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制,脱盐时高径比为5:1 即可;
7. 洗脱方法:
可以用无盐水,也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化;
8. 在位清洗(CIP)
凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
交联葡聚糖微球Cross Link Dextran
交联葡聚糖凝胶的商品名,系以右旋糖酐与1-氯-2,3-环氧丙烷(表氯醇)交联制备而成的具有网状结构、水不溶性珠状微粒,用于凝胶过滤。可根据分离物分子量范围选用适当交联度的凝胶,交联度(G)越大,网络孔径越小,在水或盐溶液中溶胀时吸水量越小,适用分离物的分子量范围越窄。按交联度从大到小,依次有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200等型号,数字表示干凝胶溶胀时吸水量的10倍,如G-10每1g干凝胶吸水量为1g,余类推。Sephadex具有稳定性好、吸附性小等优点,但可被强酸、强碱或氧化剂破坏降解。广泛用于低压凝胶过滤分离分子量大小不同的化合物。在凝胶上引入羟丙基后具亲脂性,可在有机溶剂中膨胀而用于有机物的分离,如LH-20型葡聚糖凝胶便是G-25型凝胶的羟丙基衍生物。引入极性基团,如羧甲基(-CH2COOH,CM型)、磺乙基(-CH2CH2SO3H;SE型)、磺丙基(-CH2CH2CH2SO3H,SP型)、二乙氨基乙基(-CH2CH2N(C2H5)2,DEAE型)、季铵乙基(-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3,QAE型)等则使凝胶具离子交换剂性质,多用于蛋白质、多肽、生物碱等的分离,其表示方法,如DEAE-SephadexA-50即表示由G-50型制备的含DEAE基团的阴离子交换剂,SP-SephadexC-25则为由G-25制备的含磺丙基的阳离子交换剂等。